RNA作為以DNA單鏈為模板的遺傳信息載體，其編輯相比DNA編輯而言，由于不會永久改變基因組，因此在安全性上有著不言而喻的優(yōu)勢。然而相對于DNA編輯，靶向RNA的編輯還沒完全被大眾熟悉，其實從上個世紀90年代起，對RNA編輯的自然過程已有了較多的認識。近年來也逐漸開始進化成為真正的RNA“編輯器”，并且已進入一個快速前進的軌道，上一期已為大家介紹了自然狀態(tài)下RNA在翻譯前的調節(jié)過程及操作原理，本期具體看看這些神奇的RNA編輯工具。

 

DNA和RNA的編輯最新發(fā)展是基于對ADAR蛋白以及CRISPR技術相關的酶的研究。對這些酶的深入認識為有效地操縱特定的分子特征以測試其功能開辟了新的機會。從整體上來劃分，我們可以把RNA編輯（操作）工具分為兩大類，其實也就是兩大類酶復合物。這兩類工具在不同的角度對RNA進行“編輯”，大大拓寬了我們對RNA進行操作的能力。

 

1.一種是RNA效應元件，這些效應元件主要是可以對RNA進行識別，靶向與切割，這種“編輯”是一種較為寬泛意義上的編輯；

2.另一種可稱為單堿基RNA編輯器，這類編輯器主要依托于ADAR蛋白或ADAR蛋白的變體，可以在單個堿基尺度上完成RNA水平上的“A-to-I”或“C-to-U”，并且具有較強的單堿基突變型遺傳疾病的治療潛力。

 

RNA效應元件的開發(fā)

 

如小編之前所說，RNA效應元件可以對RNA進行識別，靶向與切割。看到這幾個詞，大家或許很快就想到了我們以CRISPR/Cas為代表的基因編輯工具。確實，在CRISPR/Cas誕生之后，科學家們也在一直思考，是否可以將基于Cas蛋白結合DNA的一些特性與應用轉移至RNA上。而正是在這樣的想法催生下，基于CRISPR的RNA效應物誕生了。接下來就一起看看其中的代表吧。

 

1. RCas9

命名：RCas9，顧名思義，就是RNA靶向的Cas9（RNA-targeting Cas9）

研究團隊：基因編輯技術研究的領軍人物Jennifer Doudna的團隊于2014年開發(fā)得到 [1]

原理：利用Cas9可識別與結合PAM序列的原理，設計了一種被稱為PAMmers的PAM遞呈寡核苷酸，可以讓Cas9特異定向識別并結合到單鏈RNA(ssRNA)特異位點上并完成切割。如果將RCas9與一種蛋白質翻譯起始因子連接到一起并靶向特異的mRNA，那么就還可以起到對這個蛋白翻譯水平的調節(jié)。

應用：兩年后，Yeo實驗室與Jennifer合作，采用RCas9對ACTB、TFRC和CCNA2等內源性轉錄本進行了編輯，并對融合了熒光蛋白（如GFP）的Cas9進行觀察，開發(fā)出了在活細胞內追蹤RNA運輸的工具，在胞內RNA研究上更進了一步[2]。

圖1. RCas9原理示意圖

圖2. RCas9對活細胞中的RNA進行示蹤

 

2. C2c2

命名：CRISPR/C2c2，亦稱Cas13a，是目前第二大類CRISPR/Cas系統(tǒng)中，唯一能夠切割RNA的蛋白（諸如Cas9，Cpf1，C2c1等均是RNA介導的DNA內切酶）；

研究團隊：基因編輯領域的另一領軍人物張峰的團隊開發(fā)出的RNA靶向元件[3]；

原理：C2c2會與成熟的crRNA形成復合物，在不借助tracrRNA的情況下與單鏈RNA結合，而crRNA則會與類似PAM序列的PFS片段結合，并對單鏈RNA進行切割，從而降低相應蛋白的表達；

應用：作為一種siRNA的替代手段，做到可調節(jié)的基因“敲低”（knock down）。

圖3. C2c2系統(tǒng)示意圖

 

3. CIRTS

命名：CIRTS（CRISPR-Cas inspired RNA targeting system），一種基于CRISPR/Cas的RNA靶向系統(tǒng)；

研究團隊：今年6月，由來自美國芝加哥大學的Bryan C. Dickinson研究團隊提出[4]；

原理：CIRTS由4個核心組分構成：1）一個RNA發(fā)夾結合蛋白（RNA hairpin binding protein），可以在gRNA的引導下與特異性的RNA結構結合；2）一個gRNA，它的結構可以與設計好的發(fā)夾結合蛋白相互作用，同時它的序列與靶RNA互補；3）一個單鏈結合蛋白（ssRNA binding protein），可以與gRNA序列非特異性的結合，對gRNA起到穩(wěn)定和保護作用；4）一個效應蛋白（effector protein），比如核糖核酸酶或者表觀轉錄調節(jié)子，可以對目標RNA起特定作用。

應用：CIRTS的復合物（如：ORF5-TBP6.7-Pin nuclease）對RNA的切割能力與Cas13幾乎沒有差別，而且可以模塊化。由于它的尺寸小（2.7kb），因而可以用AAV有效裝載。組分完全來源于人類蛋白，因而可以避免機體產生免疫反應，為基因治療提供了新的工具。

圖4. CIRTS原理示意圖

 

 

單堿基RNA編輯器

 

 

顧名思義，單堿基RNA編輯器便是在RNA水平進行單堿基突變矯正的工具，在DNA尺度上，ABE工具可以完美起到“A-to-G”的變化，但是在DNA尺度上，也有這樣神奇的RNA“ABE”。與我們熟知的ABE與CBE相比，它又有哪些不同呢？

 

1. ADAR融合蛋白進行A-to-I編輯

ADAR蛋白（adenosine deaminase acting on RNA）的作用下發(fā)生的A-to-I。雙鏈RNA本就可以作為ADAR編輯的底物，而且在許多RNA靶向效應物出現(xiàn)后，科學家們便也開始嘗試，是否可以將ADAR或ADAR核心脫氨結構域與這些RNA靶向效應物結合，從而實現(xiàn)在RNA上完成A-to-I（形式上等同于A-to-G）的編輯呢？

 

研究進展：德國圖賓根大學的Thorsten Stafforst團隊和波多黎各大學的Rosenthal團隊：將ADAR的核心脫氨酶結構域與SNAP-tag[5]或λN肽[6]結合，利用gRNA將復合物（如SNAP-ADAR）攜帶至靶向編輯位點（與gRNA形成雙鏈區(qū)域）進行編輯，成功實現(xiàn)了靶位點A-to-I的轉換。

圖5. ADAR融合SNAP-tag或λN肽進行A-to-I編輯

 

張峰團隊：在Cas13系統(tǒng)出現(xiàn)后，張峰也將ADAR脫氨酶結構域與dCas13b融合，開發(fā)出基于Cas13系統(tǒng)的A-to-I編輯工具：REPEIR（RNA Editing for Programmable A to I Replacement）[7]。

圖6. REPEIR原理示意圖

 

2. 利用內源性ADAR進行A-to-I編輯

雖然這樣的融合蛋白在RNA的A-to-I編輯上展現(xiàn)出了良好效果，但是仍然存在著幾大問題：

1. 蛋白分子量過大，使得通過病毒載體進行裝載及人體內遞送十分困難；

2. 由于蛋白過表達可能引起潛在的脫靶效應；

3. 外源蛋白表達有可能引起機體產生免疫反應；

4. 機體內的抗體有可能會和蛋白發(fā)生中和反應從而導致編輯失敗。

 

在這樣的問題之下，科學家們在RNA編輯工具開發(fā)上也在嘗試進行新的探索。今年的3篇Nature子刊給我們打開了RNA編輯的新思路：那就是利用內源性ADAR來進行RNA編輯。

 

研究進展：

德國杜賓根大學的Stafforst團隊：今年1月在Nature Biotechnology發(fā)文，提出了一種名為RSETORE（recruiting endogenous ADAR to specific transcripts for oligonucleotide-mediated RNA editing）的方法。RESTORE使用了一段化學合成的寡核苷酸（ASO）與靶序列進行互補配對，并添加了與靶向GluR2 mRNA相似的R/G motif作為ADAR的招募域（可見上一期公眾號對ADAR蛋白原理的介紹），利用人體細胞中已經存在的ADAR蛋白進行RNA編輯[8]。與IFN-α結合，RESTORE的編輯效率甚至可達80%。在研究中，RESTORE高效修復了導致α1-抗胰蛋白酶缺乏的PiZZ突變，并有效編輯了信號因子活性開關STAT1中的重要位點磷酸酪氨酸701。

 

加州大學圣地亞哥分校的Mali博士：今年2月，在Nature Methods上再度驗證，只使用改造過的指導RNA，就可以與ADAR結合并且將它帶到正確RNA序列，并且在小鼠模型中修復了與肌營養(yǎng)不良癥和鳥氨酸轉氨甲酰酶缺乏癥相關的突變[9]。

圖7. RESTORE原理示意圖

 

北京大學魏文勝課題組：今年7月，也在Nature Biotechnology上發(fā)文，提出了一種名為LEAPER（Leveraging Endogenous ADAR for Programmable Editing on RNA）的方法，只需轉入一條特殊設計的RNA (arRNA, ADAR-recruiting RNA)，就能夠通過招募細胞內源的ADAR1 蛋白對靶向基因轉錄本上特定的A產生高效精準的編輯，并不需要引入任何外源效應蛋白。LEAPER在疾病治療領域的作用也得到了充分驗證。比如LEAPER可以通過修復抑癌基因TP53中的致病突變來恢復p53突變體的轉錄調節(jié)功能。此外，在Hurler綜合征患者來源的原代細胞中，LEAPER能夠成功修復致病突變，并恢復細胞中的α-L-艾杜糖醛酸酶的催化活性。相比于需要進行化學修飾的RESTORE，LEAPER可以通過穩(wěn)定表達的方式在細胞內發(fā)揮作用，因此適用于裝載至腺相關病毒 (AAV)、慢病毒等載體中，在遞送至機體后持續(xù)發(fā)揮功能[10]。

圖8. LEAPER原理示意圖

 

3. C-to-U的RNA編輯

雖然ADAR可以良好地完成A-to-I的RNA編輯，但是針對于C-to-U的RNA編輯，先前的科學家們還沒有找到較好的手段。

研究進展：今年7月，張峰實驗室通過分子進化的方法，使ADAR2酶具有了可以將胞嘧啶（C）轉化為尿嘧啶（U）的全新能力，與此同時，它原先將A轉化為I的功能依舊得到了保留。通過進一步優(yōu)化，該工具的脫靶效應也被良好地進行控制。這個全新的C-to-U工具被命名為RESCUE（RNA Editing for Specific C to U Exchange），打開了一個新的RNA編輯世界的大門[11]。為了驗證該工具在疾病治療上的潛力，研究者們對編碼與阿爾茨海默病有關的風險因子APOE4的RNA進行了編輯。RESCUE系統(tǒng)成功地將APOE4 RNA中的2個堿基從C變成了U，從而轉換為了安全無害的APOE2。

圖9. RESCUE原理示意圖

 

看到這里，大家是否對RNA編輯產生一個新的認識呢？這樣的工具不僅為RNA的研究開拓的新方向，而且為疾病的基因治療提供新的工具。當然，除了遺傳性疾病之外，在很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程之中，也伴隨著RNA編輯的發(fā)生。那么下一期的公眾號，就讓我們一起了解一下RNA編輯與腫瘤吧！

 

參考文獻：

[1]O'Connell MR, Oakes BL, Sternberg SH, et al. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature, 2014, 516 (7530): 263-266.

[2]Nelles DA, Fang MY, O'Connell MR, et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell, 2016, 165 (2): 488-496.

[3]Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Konermann S, et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science, 2016, 353 (6299): aaf5573.

[4]Rauch S, He E, Srienc M, et al. Programmable RNA-Guided RNA Effector Proteins Built from Human Parts. Cell, 2019, 178 (1): 122-134.

[5]Stafforst T, Schneider MF. An RNA-deaminase conjugate selectively repairs point mutations. Angew Chem Int Ed Engl, 2012, 51 (44): 11166-11169.

[6]Montiel-Gonzalez MF, Vallecillo-Viejo I, Yudowski GA, et al. Correction of mutations within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by site-directed RNA editing. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013, 110 (45): 18285-18290.

[7]Cox DBT, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, et al. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science,  2017, 358 (6366): 1019-1027.

[8]Merkle T, Merz S, Reautschnig P, et al. Precise RNA editing by recruiting endogenous ADARs with antisense oligonucleotides. Nat Biotechnol, 2019, 37 (2): 133-138.

[9]Katrekar D, Chen G, Meluzzi D, et al. In vivo RNA editing of point mutations via RNA-guided adenosine deaminases. Nat Methods, 2019, 16 (3): 239-242.

[10]Qu L, Yi Z, Zhu S, et al. Programmable RNA editing by recruiting endogenous ADAR using engineered RNAs. Nat Biotechnol, 2019, 37 (9): 1059-1069.

[11]Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Franklin B, et al. A cytosine deaminase for programmable single-base RNA editing. Science, 2019, 365 (6451): 382-386.