過去三十年來，全球肥胖和2型糖尿病的發病率有所上升，而脂肪組織是肥胖相關疾病的重要因素，因此，控制脂肪細胞分化和成熟可能是治療肥胖相關疾病的一個有希望的策略（1）。為了闡明轉錄和表觀遺傳調控在脂肪形成中的作用，并確定一個主要的關鍵調控因子和途徑（1，2），人們做了大量的努力，然而，轉錄后調控在脂肪形成中的作用尚不清楚。

 

鋅指蛋白217（Zfp217，人類同源蛋白ZNF217）是一種在多種人類腫瘤（4，5）中上調的已知致癌蛋白，也是胚胎干細胞分化的關鍵蛋白（3，7，8）。值得注意的是，Zfp217將基因轉錄與新生RNA上的m6A修飾緊密結合，提示Zfp217在協調表觀遺傳和表觀轉錄網絡中的關鍵作用（3，9）。雖然我們之前確定了一個新的角色對于脂肪發生中的Zfp217，詳細的Zfp217依賴機制尚未得到很好的描述（10，11）。然而，這些研究增加了Zfp217可能通過調節m6A修飾來加速脂肪生成的可能性。

 

為了闡明Zfp217蛋白在脂肪生成中的作用，華中農業大學動物科學與技術學院動物營養與飼料科學系的彭建教授團隊，通過sRNAi、CRISPR/Cas9、Co-IP， OpenSPR  LSPR技術等實驗方法， 最終確定Zfp217通過介導m6A mRNA甲基化編排轉錄和轉錄后調節，促進了脂肪分化并將該結果于2019年4月發表于《Nucleic Acids Research, 2019》（IF 11.5）。

 

 

 

具體實驗內容

 

通過sRNAi、CRISPR/Cas9、流式、Co-IP， LC-MS/Ms、Chip等實驗方法，發現Zfp217，YTHDF2 ， FTO， m6A RNA之間在脂肪生成過程中形成了一個調控環路， Zfp217缺失會抑制脂肪生成，并通過OpenSPR的LSPR技術檢測確定了不同因子之間相互作用關系：

1）提取總RNA定量PCR分析，對m6A做點雜交及質譜分析發現RNAi及CRISPR/Cas9處理后缺失了Zfp217的細胞中， m6A修飾水平明顯增加；LC-MS/Ms 發現 m6Am在Zfp217缺失的細胞中顯著增加，m6A是m6Am的10倍，意示m6A可能是主要的關注點；點雜交實驗顯示，m6A的水平沒有變化。但是缺失Zfp217的細胞中，m6A 修飾顯著增加，暗示Zfp217對m6A RNA甲基化起關鍵的作用；并且pull-down實驗顯示FTO 和YTHDF2與m6A ssRNA 競爭結合，CO-IP檢測發現Zfp217 與 YTHDF2存在相互作用。

 

 

2）LSPR 檢測：為了確定Zfp217 與 YTHDF2是否是直接相互作用及闡明上述三者之間的關系，本研究利用Nicoya OpenSPR 的LSPR技術，YTHDF2固定在芯片上，檢測了Zfp217與YTHDF2、、m6A ssRNA 三者之間的相互作用情況，結果顯示Zfp217 與 YTHDF2之間親和力很高，是直接相互作用，并且Zfp217會阻止包含m6A的 ssRNA與 YTHDF2的結合（圖2），這個數據科學直觀的解析了后期關于Zfp217與YTHDF2相互作用以使FTO 能與m6A結合 ，從而增強了FTO對m6A RNA的定位和去甲基化酶活性（圖1）。

 

 

 

總的來說，這項研究首次證明了Zfp217在脂肪生成中的復雜作用。Zfp217與m6A去甲基化酶FTO的啟動子直接結合，并與m6A“閱讀器”蛋白YTHDF2相互作用，從而增強了FTO對m6A RNA的去甲基化酶活性。最終，Zfp217以依賴于m6A-YTHDF2的方式促進脂肪生成（圖3）。

 

 

參考文獻

 

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