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   核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)是光合作用碳同化關鍵酶，在藻類、植物以及部分光合細菌中保守存在。Rubisco是植物葉片中含量最豐富的蛋白質，也是地球上含量最多的蛋白質。Rubisco固碳效率非常低，是光合作用的限速酶，而藻類和少數(shù)植物可以利用二氧化碳濃縮機制(CO₂-concentrating mechanism, CCM)以提高碳同化效率。

   藍細菌的α-和β-羧酶體含有由八個大亞基(RbcL)和八個小亞基(RbcS)組成的Rubisco以及碳酸酐酶復合物。由于HCO₃^-可以通過擴散進入羧酶體外殼而CO₂不能，碳酸酐酶復合物因此可以產(chǎn)生高濃度的CO₂用于Rubisco的碳固定。羧酶體外殼還可以防止還原劑進入，產(chǎn)生并保持內(nèi)部的氧化環(huán)境。β-羧酶體的形成涉及由CcmM蛋白介導的Rubisco聚集。

    CcmM蛋白以兩種形式存在：其一為M58，發(fā)現(xiàn)于細胞聚球藍細菌中全長的CcmM，N端包含有碳酸酐酶樣(carbonicanhydrase-like,CA)結構域，隨后是三個通過柔性linker連接Rubisco小亞基樣(Rubisco small subunit-like,SSUL)模塊；另一種為M35缺乏碳酸酐酶樣(CA)結構域(圖2g)。一直以來，人們認為SSUL模塊通過替換RbcS與Rubisco相互作用。但是，真實的情況和具體的分子機制并不清楚。

    近期，德國馬普生化所Manajit Hayer-Hartl課題組在Nature雜志在線發(fā)表了題為Rubiscocondensate formation by CcmM in β-carboxysome biogenesis的研究論文，報導了Rubisco-CcmM復合物結構，并且通過生理實驗驗證了Rubisco在β-羧酶體生物發(fā)生過程中由CcmM介導的相變過程的分子機制。

    此前有文章報道細胞通過一些使酶區(qū)域化的機制，作為調節(jié)代謝途徑和提高其效率的策略。近期研究的熱點相變是這個區(qū)域化作用的一種突出體現(xiàn)。

    在這篇文章中，Hayer-Hartl課題組的研究人員不僅重組了Rubisco-CcmM復合物，解析了它的結構，還觀測到了Rubisco相變過程對于酶活的重要性。了解羧酶體的生物發(fā)生對于未來將二氧化碳濃縮機制引入植物中具有重要意義。

    此前的推測是SSUL模塊通過替換RbcS與Rubisco相互作用，而從解析的Rubisco-CcmM復合物結構來看，SSUL模塊結合在RbcL二聚體之間靠近Rubisco的“赤道”區(qū)域，連接Rubisco分子并誘導相分離成液體狀基質。

    他們首先解析了藍細菌中CcmM的SSUL1的晶體結構(圖1a)，SSUL1與此前報導的RbcS結構同源，但是序列不同源(圖1b)。并且，此結構是氧化狀態(tài)下的結構，可以看到Cys261和Cys279之間的二硫鍵。同時，他們也解析了還原狀態(tài)下的SSUL1結構，除了沒有二硫鍵，其他與氧化狀態(tài)下一致。

圖1. SSUL1的氧化狀態(tài)晶體結構和M35介導的與Rubisco形成的網(wǎng)絡結構。a：Se7924中CcmMD的氧化態(tài)SSUL1(旋轉90°雙視圖)；b：SSUL1(洋紅)與Se6301的RbcS(綠色)形成的網(wǎng)絡結構

    通過生化實驗，他們發(fā)現(xiàn)Rubisco和M35按一定比例混合會變渾濁，形成聚集網(wǎng)絡，并且驗證該復合物是有功能的。但同時也發(fā)現(xiàn)，不管是單獨的SSUL，還是M13-1,M13-2或M13-3(圖2g)，都不能形成該網(wǎng)絡。只有M24-1/2(SSUL1&SSUL2)組合才能介導Rubisco網(wǎng)絡形成(圖2h,i)。

圖2. M58和M35的結構域截短組合和Rubisco-M35的結合&解離生化實驗

    接著他們發(fā)現(xiàn)Rubisco-M35的網(wǎng)絡動態(tài)特性表明這些蛋白質經(jīng)歷了液-液相分離(LLPS)。通過熒光實驗，將Rubisco和M35red按一定比例組合，可誘導分層成圓形熒光冷凝物，符合液滴的特征，確定是LLPS現(xiàn)象。與Rubisco在綠藻類淀粉核中的行為類似，在更具活力的氧化條件下，M35可將Rubisco濃縮成液體基質，與羧酶體中的狀態(tài)一致。

圖3. Rubisco凝結成具有液體特性的網(wǎng)絡

    研究發(fā)現(xiàn)，在晶體結構中看到的SSUL中的二硫鍵對于羧酶體的生物學功能很重要，它增加了基質網(wǎng)絡的靈活性，并且是體內(nèi)羧基體功能所必需的。

    通過使用Cholorolab2+液相氧電極(英國，Hansatech)，評估野生型和突變型Se7942菌株對無機碳(Ci)的光合親和力差異，評估其在Ci濃度范圍內(nèi)的O₂釋放速率。突變掉相關的Cys，將SSUL1或SSUL2中二硫鍵的破壞，會導致羧酶體對CO₂的需求量增加約10至20倍，倍增的時間增加約2至2.5倍(圖4)。

圖4.二硫鍵在SSUL中的羧基功能作用。野生型Se7942和CcmM突變株對外部Ci的光合作用釋放O₂速率響應。使用經(jīng)典Clark型氧電極(Cholorolab2+，Hansatech)，通過從10μm到250mm Ci測定不同菌株Se7942對Ci依賴性放氧速率。半胱氨酸突變體(C279S、C395S和CcmM-4s)具有中等的需要CO₂表型，而其中CcmM-4s具有最高的二氧化碳需求量。

    為了解M35-Rubisco相互作用的分子基礎，他們通過cryo-EM和單粒子分析解析到了復合物結構，在Rubisco“赤道”附近發(fā)現(xiàn)了額外的電子密度，通過結構修正，解析了完整的Rubisco–SSUL復合物結構(圖5)。

    結構顯示4個SSUL模塊結合一個Rubisco，與RbcL二聚體和RbcS之間的界面通過鹽橋、范德華力等作用力互作。同時，他們發(fā)現(xiàn)SSUL與RbcS的互作對此前發(fā)現(xiàn)的Rubisco網(wǎng)絡的形成非常重要。

圖5. M35-Rubisco的Cryo-EM結構

    因此，Rubisco的液體狀縮合物的形成是通過與SSUL結構域的動態(tài)相互作用介導的，而不是通過低復雜性序列介導的，這與其它文獻中的報道結果是一致的。