單細胞轉錄組測序是這兩年來非常流行的高通量組學研究工具，然而，是不是所有的研究都適合用該方法？是不是所有的問題都可以通過該方法來解釋？這是一個值得探討的問題。從現有的研究報道來說，單細胞轉錄組學研究很好地解決了細胞圖譜，發育過程等重要的生物學問題。但是在相對比較傳統的研究方向，是否也能利用單細胞轉錄組測序方法來使研究更加深入和出色？

本期小編通過對近期發表在《Cell Stem Cell》上的文獻的重點內容解析，來領略下生發機制研究中，單細胞轉錄組學的巧妙運用，如何為解釋內在的生發關鍵時期的調控通路提供了直接證據。

研究背景

哺乳動物毛發生命周期是由毛囊（HF）經歷了由生長期（anagen）,退化期（catagen）和休止期（telogen）為代表的三個重要精細調控階段。來自毛囊干細胞（HFSCs）的角質細胞接受到如Wnt或者Shh等通路的激活信號后，會在生長期促進細胞增殖；在休止期接受到如BMPs等抑制信號時，會促進細胞靜止過程。

JAK-STAT通路調控休止期靜止的潛在上游調控信號被認為是一些細胞因子家族的因子。制瘤素（OSM）顯示出抑制plucking誘導的生長期，而IL-6可以誘導毛囊從生長期進去退化期。OSM和IL-6屬于gp130-dependent家族的一類細胞因子，可誘導LIF，CT-1，CNTF的產生。在本研究中，研究人員發現OSM抑制JAK-STAT通路誘導的毛發生長過程，可能是作為一種內源的抑素維持休止期。通過進一步的單細胞測序和驗證，發現OSM是由一類TREM2+的巨噬細胞在休止期早期產生來影響毛發生長周期的過程。

圖1 研究主要結果展示

研究主體

為研究OSM在毛發生長過程中的調控作用，本研究先進行了一系列的傳統分子生物學實驗，得到以下幾個結論：

1. OSM通過OMSR-JAK-STAT信號通路維持毛囊處于休止期；
2. OSMRβ和其共受體gp130在早期和中期休止期時，在HFSCs細胞凸起與胚芽中，共定位激  活pSTAT5；
3. OSMRb信號通路的干擾縮短了第二個休止期周期；
4. 在休止期中期干擾OMSRβ和STAT5表達促進HFSC的增值和生長期起始；
5. 真皮細胞中的OSM來源于休止期組織中的巨噬細胞；
6. 巨噬細胞產生的OSM在體外能抑制HFSC的增殖；

通過以上的實驗，該研究已經打通了OSM影響生發過程中的重要調控過程以及OSM的主要來源問題，應該來說是傳統生物分子機制實驗的標準操作。但是，該研究沒有將結論停留于此，運用單細胞轉錄組測序手段，該研究繼續往前走了一大步。

那么運用單細胞轉錄組測序，研究人員到底做了些什么，發現了什么呢？

7. 真皮中CD4+免疫細胞進行單細胞轉錄組測序

研究人員對休止期早（P45）中（P50，P63）晚（P80）三個時期的真皮CD45+免疫細胞進行了單細胞轉錄組測序（10XGenomics平臺）。分析顯示，P45時期的細胞共分成13個不同的Cluster。利用已有的巨噬細胞markers CD68，F4/80（Adgre1）和Csf1r，P45期巨噬細胞重新細分到其中的5個不同的cluster中：0，1，2，5，11。而OSM主要是在Cluster11中表達豐度較高。

8. 產生OSM的巨噬細胞是TREM2+且有著獨特的基因表達譜

通過對每個cluster中的顯著上調基因進行聚類，可以發現Cluster 6 細胞和“M2-like”的Cluster3表達模式很相似。有意思的是，這兩類細胞可以用TREM2 marker區分來開，TREM2特異性地在生產OSM的Cluster 6中表達。

利用在線資源Enrichr對cluster 6的基因分析發現，其功能主要與小神經膠質相關，是中樞神經的長期組織駐留巨噬細胞。小神經膠質細胞相關的marker（Apoe,Aif-1,Cx3cr1和Tmem119）都在該類細胞中由表達。因此，OSM和TREM2是culster 6中特異性高表達的基因。

圖3 產生OSM的巨噬細胞的表達特征譜

9. TREM2+巨噬細胞與HFSCs關系密切

研究人員對小鼠真皮組織選取30 μm組織塊進行markers免疫熒光檢測，發現Aif-1和CD11b與OSM在P45期的毛囊免疫細胞中共定位；TREM2和F4/80與OSM在靠近休止期HFSCs的巨噬細胞中共定位。這部分的結果表明，OSM由處于休止期HFs中的TREM2+巨噬細胞產生。

10. 休止期后TREM2+巨噬細胞會減少

如果TREM2+巨噬細胞抑制HFSC的增值，那么在下一輪的生長期之前應該會減少。為驗證這樣的假設，研究人員對休止期的三個不同時間點的單細胞數據進一步分析。結果顯示，隨著休止期過程的發展，CD45+免疫細胞的多樣性逐漸減少，從P45的13類減少到P63的3類。且產生OSM的細胞類群由P45到P50時，也變少了，在P63和P80更加減少。這樣的結果通過流式細胞計數也得到了驗證。對OSM和小膠質細胞markers的軌跡分析也顯示，休止期它們的表達持續減少。因此，休止期，TREM2+巨噬細胞通過產生OSM，影響OSMRβ-STAT5信號通路，維持HFSC細胞的靜止狀態。

通過以上分析，該研究不光找到了OSM怎么影響休止期過程，也發現了OSM真正的產生來源是一類TREM2+巨噬細胞。后期，在休止期通過遺傳學手段，抗體中和和小分子抑制劑抑制巨噬細胞，發現可以有效誘導生長期過程。

以上是該研究的主要內容及單細胞研究過程中的重點解析。可以看到，該研究通過單細胞轉錄組實驗，一方面解釋了OSM到底是由哪一類特定的巨噬細胞產生而來；同時也發現了OSM在休止期三個不同階段的變化過程，可以說巧妙地將單細胞技術非常完美地利用了起來。因此，單細胞轉錄組學測序技術，只要能進行合理的設計和規劃，相信廣大的研究中都可以利用起來。

參考文獻：Wang, E.C.E., et al., A Subset of TREM2(+) Dermal Macrophages Secretes Oncostatin M to Maintain Hair Follicle Stem Cell Quiescence and Inhibit Hair Growth. Cell Stem Cell, 2019. 24(4): p. 654-669 e6.

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