Nat. commun | Mettl3介導的m6A RNA甲基化調控骨髓間充質干細胞和骨質疏松癥的命運

文章導讀：
近日，四川大學華西醫院的周學東和袁泉研究組，聯合中山大學第一附屬醫院的林水賓團隊合作研究共同揭示了Mettl3介導m6A RNA甲基化調控骨髓間充質干細胞和骨質疏松癥命運的新機制。該研究成果以Mettl3-mediated m6A RNA methylation regulates the fate of bone marrow mesenchymal stem cells and osteoporosis為題，于11月14日在《Nature communications》(IF:12.353)雜志在線發表。
 

 

研究思路
研究團隊首先利用CRISPR-Cas9技術構建了MSCs有條件的敲除和敲入Mettl3的模型小鼠，然后微型CT和染色顯示敲除后導致低骨量和高骨髓脂肪，并且MSCs中m6A整體甲基化水平也有所降低；同時，與執行了卵巢切除術的模型鼠相比，Mettl3過表達可預防雌激素不足引起的骨質疏松；接下來通過m6A MeRIP-seq和RNA-seq技術發現Mettl3缺失的MSCs存在PTH調控基因表達的全局下調，提示PTH/Pth1r信號軸可能是Mettl3介導的m6A甲基化對MSCs命運的影響通路。PTH間歇性注射實驗也是印證了m6A通過調節PTH/Pth1r信號軸影響MSCs的成骨和脂肪分化的結論。另外，Pth1r的過表達可以在很大程度上逆轉MSCs向脂肪細胞的傾斜分化，改善成骨，進一步證實了PTH/Pth1r信號通路是mettl3介導的m6A修飾控制MSCs譜系分配的新機制。

研究內容
1. MSCs 中Mettl3的敲除可導致低骨量、高骨髓脂肪
利用CRISPR-Cas9技術構建了MSCs有條件的敲除Mettl3的模型小鼠，股骨石蠟切片免疫染色和WB驗證了Mettl3的敲除是的成功的。結果顯示Mettl3敲除小鼠與對照組相比，骨質量損失且骨髓脂肪組織積聚顯著，其骨骼特征與骨質疏松癥的病理表型相似。同時LC-MS/MS檢測發現MSCs中m6A甲基化整體水平下降。
 

 
 

2. MSCs中Mettl3的缺失導致成骨潛能降低和脂肪分化增加
接下來，從Mettl3敲除的小鼠中分離出MSCs以驗證其體外成骨和成脂潛能。堿性磷酸酶染色活性減弱，鈣化減少，并且成骨標志物Runx2, Sp7, Alp和 Bglap 表達下調，表明缺失的MSCs成骨能力不強。相反，油紅O染色強度的增加和顯著的高表達是脂肪形成的潛在因素，包括Pparγ, Cebpα, Adipoq, Plin1和 CD36。

3. Mettl3過表達可預防雌激素不足引起的骨質疏松
為了印證Mettl3過表達是否能夠增強骨骼健康或預防骨骼疾病，在這里構建了MSCs中有條件的敲入Mettl3，使其在MSCs中過表達。通過卵巢切除術建立骨質疏松癥實驗模型，與對照相比Mettl3過表達增加了卵巢切除術后小鼠成骨細胞數量，但不影響破骨細胞活性。H&E染色和組織形態學分析顯示，去卵巢的對照組小鼠骨髓脂肪細胞過度積累，而去卵巢的Mettl3敲入小鼠骨髓脂肪細胞的增加較小。

 

4. m6A調控甲狀旁腺激素受體-1（Pth1r）的翻譯
通過m6A MeRIP-seq技術對MSCs中m6A具體情況進行分析，結果顯示m6A峰主要位于CDS和3’UTR區，并且主要位于終止密碼子附近。還發現Pth1r是MSCs和成骨細胞前體中譜系分配的關鍵調控因子，在其翻譯終止密碼子附近具有高富集和特異性的m6A峰。RNA-seq發現Mettl3缺失的MSCs存在甲狀旁腺激素（PTH）調控基因表達的全局下調，提示PTH/Pth1r信號軸可能是Mettl3介導的m6A甲基化對MSCs命運的影響通路。

 

5. m6A對于PTH功能是必不可少的
Mettl3敲除的小鼠經PTH處理后骨重塑未見明顯增強，證實敲除Mettl3可減弱PTH誘導的成骨作用。PTH除了在成骨過程中顯著富集外，還能抑制脂肪細胞分化，促進骨形成。PTH間歇性注射顯著降低了Mettl3敲除小鼠體內MAT的積累，但很難逆轉Mettl3缺失小鼠中較高的骨髓脂肪含量；Pth1r過表達改善了m6A還原引起的油紅O染色強度增加，顯著提高ALP活性和鈣結節形成。Pth1r的過表達可以在很大程度上逆轉MSCs向脂肪細胞的傾斜分化，改善成骨，進一步證實了PTH/Pth1r信號通路是mettl3介導的m6A修飾控制MSCs譜系分配的新機制。

 

總結
Mettl3介導的真核生物m6A RNA甲基化修飾對穩定體內穩態具有廣泛的功能影響，而m6A水平的任何擾動都可能導致功能障礙或疾病。在這里研究證實了骨髓間充質干細胞中Mettl3的缺失破壞了小鼠的細胞命運，導致骨質疏松癥病理表型如成骨潛能不全的骨量減少、成骨潛能增強的骨髓脂肪增多等，揭示了m6A對骨髓間充質干細胞的有效特異性調控。此外，Mettl3功能的增加可以預防雌激素不足引起的絕經后骨質疏松癥，確立了Mettl3在確定骨髓MSC命運中不可或缺的作用，從而保證骨骼健康。早期骨髓間充質干細胞中m6A表觀遺傳修飾的減少抑制哺乳動物Pth1r的翻譯，并在骨積累過程中阻斷其對PTH的合成反應。這些功能缺陷使MSC微妙的分化平衡向脂肪譜系傾斜，導致嚴重的骨質流失和過度的MAT堆積。實驗數據豐富了m6A調控干細胞分化的證據，揭示了調控不當的m6A修飾與骨病理障礙之間的功能聯系，從而為骨質疏松癥治療新策略的開發提供了可能。
全文鏈接
https://www.nature.com/articles/s41467-018-06898-4
 
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