看表觀新修飾-6mA甲基化如何助力IF飆升!
DNA甲基化修飾是表觀遺傳研究的熱點之一，我們通常認為DNA甲基化就是胞嘧啶甲基化（5-methylcytosine, 5mC），卻不知道隨著測序技術的快速發展，科研者們已經在真核生物中（果蠅 、真菌、萊茵衣藻、秀麗隱桿線蟲等）發現了一種新的DNA甲基化修飾—DNA-6mA甲基化，且DNA-6mA甲基化能影響基因表達，在動植物的生長發育過程中發揮著關鍵的調控作用，同時與包括癌癥在內的多種人類疾病密切相關。這些發現成功地掀起了科學家們對DNA-6mA的研究熱潮，使DNA-6mA成為表觀遺傳學領域的研究熱點中的熱點。接下來就以幾篇經典案例為大家介紹DNA-6mA。
DNA methylation on N6-adenine in mammalian embryonic stem cells.NATURE, IF: 44.958
作者以SMRT-ChIP、RNA-seq和6mA-IP seq三種技術相結合的方法研究小鼠基因組甲基化。研究發現小鼠胚胎干細胞中存在另一種DNA甲基化修飾—6mA甲基化；Alkbh1是腺嘌呤甲基化修飾的一種去甲基化酶，在Alkbh1基因缺失突變小鼠細胞中腺嘌呤甲基化水平增加，進而導致轉錄沉默。揭示了哺乳動物表觀修飾的重要組成部分—6mA甲基化，在哺乳動物中發揮沉默基因表達的功能，而不是如其他生物體中激活基因表達的作用。
作者以SMRT-ChIP、RNA-seq和6mA-IP seq三種技術相結合的方法研究小鼠基因組甲基化。研究發現小鼠胚胎干細胞中存在另一種DNA甲基化修飾—6mA甲基化；Alkbh1是腺嘌呤甲基化修飾的一種去甲基化酶，在Alkbh1基因缺失突變小鼠細胞中腺嘌呤甲基化水平增加，進而導致轉錄沉默。揭示了哺乳動物表觀修飾的重要組成部分—6mA甲基化，在哺乳動物中發揮沉默基因表達的功能，而不是如其他生物體中激活基因表達的作用。
6mA分析 6mA與基因表達的關系
6mA-IP seq分析
N6-Methyladenine DNA Modification in Drosophila.Cell, IF: 31.398
作者以果蠅胚胎干細胞為材料，對其基因組中6mA修飾進行研究，發現在果蠅基因組中6mA修飾廣泛存在，這種修飾受內源去甲基化酶DMAD調控，在胚胎發育過程中呈動態變化。進一步研究發現，DMAD酶作為果蠅胚胎發育所必須的一種酶，它作用于轉座子的6mA位點，去甲基化后，轉座子的表達受到抑制。該文章發現果蠅中DNA甲基化修飾新類型-6mA，并且初步探究了6mA甲基化的調控機制。
作者以果蠅胚胎干細胞為材料，對其基因組中6mA修飾進行研究，發現在果蠅基因組中6mA修飾廣泛存在，這種修飾受內源去甲基化酶DMAD調控，在胚胎發育過程中呈動態變化。進一步研究發現，DMAD酶作為果蠅胚胎發育所必須的一種酶，它作用于轉座子的6mA位點，去甲基化后，轉座子的表達受到抑制。該文章發現果蠅中DNA甲基化修飾新類型-6mA，并且初步探究了6mA甲基化的調控機制。
6mA分布 mA體外去甲基化分析
6mA-IP seq與RNA-seq聯合分析
N6-Methyldeoxyadenosine Marks Active Transcription Start Sites in Chlamydomonas. Cell, IF: 31.398
文章利用三項6mA研究技術：6mA-IP-Seq、6mA-CLIP-Exo、6mA-RE-Seq對果蠅基因組和衣藻基因組中的6mA修飾進行研究。發現在果蠅基因組中84%的基因穩定的存在6mA修飾。且6mA主要以雙峰形式分布在TSS區域，與核小體分布相關，呈周期性分布。進一步結合RNA-seq技術發現，6mA與基因表達有緊密關系。而衣藻的基因組中的6mA甲基化修飾又有新的特點，6mA修飾主要分布在轉錄起始位點區域，以雙峰形式分布。其主要序列特征為C6mATG和G6mATC。接著通過對RNA-seq檢測到的高表達基因和低表達基因分析，發現高表達基因的TSS附近的6mA富集程度較高，而低表達基因的TSS附近的6mA富集程度較低，與5mC的分布特點相反。通過這些數據說明真核生物中的6mA修飾能夠調控基因表達。
文章利用三項6mA研究技術：6mA-IP-Seq、6mA-CLIP-Exo、6mA-RE-Seq對果蠅基因組和衣藻基因組中的6mA修飾進行研究。發現在果蠅基因組中84%的基因穩定的存在6mA修飾。且6mA主要以雙峰形式分布在TSS區域，與核小體分布相關，呈周期性分布。進一步結合RNA-seq技術發現，6mA與基因表達有緊密關系。而衣藻的基因組中的6mA甲基化修飾又有新的特點，6mA修飾主要分布在轉錄起始位點區域，以雙峰形式分布。其主要序列特征為C6mATG和G6mATC。接著通過對RNA-seq檢測到的高表達基因和低表達基因分析，發現高表達基因的TSS附近的6mA富集程度較高，而低表達基因的TSS附近的6mA富集程度較低，與5mC的分布特點相反。通過這些數據說明真核生物中的6mA修飾能夠調控基因表達。
6mA的分布特征 motif分析
peak分析
N6-Methyladenine DNA Modification in the Human Genome.Molecular Cell，IF: 14.248
RNA-6mA在前期的研究中已被證實對基因表達有重要的影響，但是對于DNA-6mA在基因表達方面的相關作用，研究并不是很清楚。而本篇文章作者首先利用6mA-IP-seq技術，通過對DNA -6mA修飾圖譜分析發現：高表達水平基因的外顯子區域具有較高的6mA豐度，并且與RNA表達水平正相關；6mA修飾位點在G蛋白偶聯受體(GPCR)相關基因中有顯著的富集，預測了6mA甲基化在GPCR相關基因表達調控中可能發揮重要作用。接著通過6mA-IP-qPCR、ALKBH1基因和N6AMT1基因的敲除和過表達等實驗，闡述了DNA-6mA甲基化的調控機制。總的來說，本篇文章的意義在于：首次破譯人類DNA N6-甲基腺嘌呤（6mA）修飾圖譜，揭示了DNA-6mA甲基化修飾在人類基因組中的調控機制和生物學功能。
RNA-6mA在前期的研究中已被證實對基因表達有重要的影響，但是對于DNA-6mA在基因表達方面的相關作用，研究并不是很清楚。而本篇文章作者首先利用6mA-IP-seq技術，通過對DNA -6mA修飾圖譜分析發現：高表達水平基因的外顯子區域具有較高的6mA豐度，并且與RNA表達水平正相關；6mA修飾位點在G蛋白偶聯受體(GPCR)相關基因中有顯著的富集，預測了6mA甲基化在GPCR相關基因表達調控中可能發揮重要作用。接著通過6mA-IP-qPCR、ALKBH1基因和N6AMT1基因的敲除和過表達等實驗，闡述了DNA-6mA甲基化的調控機制。總的來說，本篇文章的意義在于：首次破譯人類DNA N6-甲基腺嘌呤（6mA）修飾圖譜，揭示了DNA-6mA甲基化修飾在人類基因組中的調控機制和生物學功能。
DNA-6mA相關分析
云序生物 - 6mA-IP -seq一站式服務
云序生物率先開發了DNA-6mA測序技術—。其原理類似于MeDIP的免疫共沉淀測序技術，利用特異性抗體富集6mA片段，擴增后進行高通量測序及甲基化分析，以較小的數據量，快速、高效地繪制全基因組DNA甲基化水平的圖譜。
云序生物率先開發了DNA-6mA測序技術—。其原理類似于MeDIP的免疫共沉淀測序技術，利用特異性抗體富集6mA片段，擴增后進行高通量測序及甲基化分析，以較小的數據量，快速、高效地繪制全基因組DNA甲基化水平的圖譜。
1、技術服務
一站式服務：
客戶只需提供相關樣品的基因組DNA，云序生物為您完成從6mA-IP富集，文庫制備，上機測序到數據分析整套服務流程。
優化的實驗流程：
6mA-IP的富集效率是決定數據質量的關鍵，云序生物6mA-IP實驗采用預驗證的商業化抗體和精心優化的實驗流程，具有極高的效率和特異性。
嚴格的質控：
實驗的各個關鍵步驟進行嚴格的質控，全程監控實驗質量，確保客戶得到優質的數據。
專業的生物信息學分析：
云序生物具有強大的生物信息學團隊，能夠滿足客戶的各類深入數據分析需求。
2、樣本要求
樣品類型：無降解且無RNA污染的DNA樣品(適用所有有參考基因組的物種)。
樣品需求量：不少于10ug
樣品濃度：不少于50ng/ul
樣品運輸及保存：
樣品運輸：樣品置于1.5mL Eppendorf 管中，封口膜封好，干冰運輸，DNA可用冰袋運輸。
樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊切塊，液氮凍存后-80℃保存；DNA樣品短期內可-20℃，避免反復凍融。
3、數據分析
標準分析：
（1）DNA甲基化富集峰的識別
通過高通量測序和生物信息分析，識別甲基化富集的基因組區域，默認p <= 1e-5（具體參數以報告為準，云序生物會根據數據，適當調整參數）的峰為統計上顯著的甲基化區。
注：每個樣品組做一個Input，以去除基因組背景，降低假陽性率。
客戶只需提供相關樣品的基因組DNA，云序生物為您完成從6mA-IP富集，文庫制備，上機測序到數據分析整套服務流程。
優化的實驗流程：
6mA-IP的富集效率是決定數據質量的關鍵，云序生物6mA-IP實驗采用預驗證的商業化抗體和精心優化的實驗流程，具有極高的效率和特異性。
嚴格的質控：
實驗的各個關鍵步驟進行嚴格的質控，全程監控實驗質量，確保客戶得到優質的數據。
專業的生物信息學分析：
云序生物具有強大的生物信息學團隊，能夠滿足客戶的各類深入數據分析需求。
2、樣本要求
樣品類型：無降解且無RNA污染的DNA樣品(適用所有有參考基因組的物種)。
樣品需求量：不少于10ug
樣品濃度：不少于50ng/ul
樣品運輸及保存：
樣品運輸：樣品置于1.5mL Eppendorf 管中，封口膜封好，干冰運輸，DNA可用冰袋運輸。
樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊切塊，液氮凍存后-80℃保存；DNA樣品短期內可-20℃，避免反復凍融。
3、數據分析
標準分析：
（1）DNA甲基化富集峰的識別
通過高通量測序和生物信息分析，識別甲基化富集的基因組區域，默認p <= 1e-5（具體參數以報告為準，云序生物會根據數據，適當調整參數）的峰為統計上顯著的甲基化區。
注：每個樣品組做一個Input，以去除基因組背景，降低假陽性率。
（2）DNA甲基化區域富集峰的注釋
富集峰識別后，得到的是一堆基因組位置信息，通過生物信息分析利用最鄰近基因對富集峰進行注釋，并根據峰中點相對于已知基因的位置，將富集峰為啟動子峰、上游峰、內含子峰、外顯子峰、基因間峰。
富集峰識別后，得到的是一堆基因組位置信息，通過生物信息分析利用最鄰近基因對富集峰進行注釋，并根據峰中點相對于已知基因的位置，將富集峰為啟動子峰、上游峰、內含子峰、外顯子峰、基因間峰。
（3）DNA甲基化富集峰區域的在基因中的分布
（4）差異DNA甲基化區域的鑒定（DMRs）與注釋
云序生物使用diffReps軟件進行差異甲基化區（differentially methylated regions，DMRs）鑒定。默認p-value<0.0001，fold change >=2作為差異甲基化區的閾值。
云序生物使用diffReps軟件進行差異甲基化區（differentially methylated regions，DMRs）鑒定。默認p-value<0.0001，fold change >=2作為差異甲基化區的閾值。
（5）差異DNA甲基化區的GO（Gene Ontology）與信號通路分析
目的：對差異甲基化基因進行功能分類，并發現顯著性富集的功能條目。
目的：對差異甲基化基因進行功能分類，并發現顯著性富集的功能條目。
（6）DNA甲基化可視化
高級分析：
（1）DNA甲基化位點motif分析
通過序列分析結合生物信息學手段就可確定DNA甲基化修飾偏好序列，找到DNA甲基化特征Motif。
（1）DNA甲基化位點motif分析
通過序列分析結合生物信息學手段就可確定DNA甲基化修飾偏好序列，找到DNA甲基化特征Motif。
（2）DNA甲基化位點共有和特異性分析
根據注釋信息，繪制組間共有和特異性的甲基化修飾位點或基因。
根據注釋信息，繪制組間共有和特異性的甲基化修飾位點或基因。
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