介紹

對環境中未經檢驗的化學品日益普遍的關注已經產生了開發可靠和有效的篩選工具以識別可能影響人類健康的，特別是神經系統發育的化學物質的迫切需求。

我們評估了一種神經突向外生長的測定方法，通過篩選和表征所選化合物的活性，評估其是否可能對發育中的神經系統產生不利影響。選擇該測定法是因為其在神經系統發育關鍵過程的模型具有一定相關性，特別是神經元會通過延伸其神經突以形成完整的神經網絡。破壞這一過程可能會對人類和嚙齒動物產生不利影響，因此研究表明，未成熟、發育中和成熟的神經突是化學毒性的靶標。

雖然神經突向外生長測定主要用于評估發育神經毒性，但也可用于評估通過檢測神經突收縮的神經變性。此外，該測定還有可能與評估成年神經元中的神經可塑性相關。對于篩選測定，總神經突向外生長通常是指標報告中最常見的度量標準。利用自動成像還能夠對其他特征進行多參數評估，例如總分支數和總過程數，以評估化合物可抑制神經突向外生長的不同方式。

材料

•ImageXpressNano自動成像系統，配備CellReporterXpress自動圖像采集和分析軟件(MolecularDevices)
•iCell®神經元(CellularDynamicsInternational)
•Poly-d-賴氨酸預包被384孔板(CorningLifeSciences)
•層粘連蛋白(Sigma-Aldrich)
•多聚甲醛(Sigma-Aldrich)
•胎牛血清(Sigma-Aldrich)
•β-微管蛋白III(TUJ-1)(BDBiosciences)
•Hoescht(ThermoFisherScientific)
•抗β-微管蛋白抗體(BDBiosciences)
•CalceinAM(ThermoFisherScientifiic)

利用基于iPS細胞的神經突生長測定法鑒定具有神經毒性的化合物

由國際細胞動力學會(CDI)提供的人iPSC衍生的神經元(即iCell神經元)細胞，是由有絲分裂后GABA活性基團和谷氨酸能神經元組成的混合物。這些研究中使用的神經元已經由制造商培養成完全分化和純化的細胞群，并已形成對神經元標志物β-III微管蛋白和MAP28呈陽性的神經突網絡。細胞收到時為冷凍狀態，隨后解凍并根據CDI推薦的方案鋪板。將細胞接種在聚-d-賴氨酸預包被的384孔板上，并用3.3μg/mL層粘連蛋白進行處理。在化合物處理之前，每孔接種7,500個細胞，并在iCellNeurons培養基中生長48小時。這些細胞中的神經突網絡通常在接種后約24小時開始形成，并且在培養至10-12天時開始增加復雜性。在接種后48小時，我們神經突向外生長進行評估，與此同時，神經元也可能發生神經突萎縮。在6種濃度范圍(0.3,1.0,3.0,10.0,30.0和100μM)中一式兩份測試化合物。每個平板中包括多個DMSO對照(n=16)和未處理的對照(n=16)。使用高達0.3％的DMSO來評估測定中的溶劑效應。將細胞在37℃和5％CO2下暴露于化合物下72小時。接著，除去培養基，用4％多聚甲醛固定細胞2小時。用含有1％胎牛血清和0.01％皂苷的PBS中的進行透化。隨后，將細胞與抗β-微管蛋白III(TUJ-1)抗體(1:100稀釋)和2μg/mLHoechst的結合AF488染料的小鼠抗人抗體孵育3小時。β-微管蛋白用作神經突向外生長的標記物，也用于完整神經元細胞體的計數。溫育后，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)替換染色溶液。或者，還可以使用活細胞進行神經毒性測定，用鈣黃綠素AM和Hoechst染料(分別為0.5μM和2μM)染色30分鐘。有關接種密度優化的詳細信息和384孔格式測定的方案在Sirenkoetal.6中有詳細描述。

使用ImageXpressNano自動成像系統的10倍PlanFluor物鏡拍攝各孔的圖像。在384孔板中的每個孔的單個位點捕獲一個10x圖像。10x物鏡提供了足夠的分辨率來區分每個圖像中大量細胞(500-1,000)的神經突網絡和亞細胞結構，能覆蓋表總孔面積的約1/4。在獲取圖像之后，使用CellReporterXpress™自動圖像采集和分析軟件完成所有圖像分析，該軟件包含用于神經突向外生長和活力評估的圖像處理應用模塊。作為圖像處理的示例，圖1表示出了來自神經突圖像和相應分析圖層的放大的典型圖像。圖2顯示來自DMSO處理的神經元和化合物處理的神經元的圖像，在其相應結構上有軟件追蹤的覆蓋圖層。

^{圖 1 ß-微管蛋白 ( 綠色 ) 染色的圖像和對照細胞的軟件分析軌跡。將 iCell 神經元鋪板培養 5 天，然后 固定，并用 AF 488 結合的抗-β-微管蛋白 (TUJ-1) 抗體 (1:100) 染色。圖像由 ImageXpress Nano 系統 使用 10x Plan Fluor 物鏡和 FITC 通道拍攝。使用 CellReporterXpress 軟件中的 Neurite Tracing 分析 算法處理圖像。右側的分析圖層顯示細胞生長 ( 綠色 ) 和細胞體 ( 藍色 )}

^{圖 2 ß-微管蛋白 ( 綠色 ) 和 Hoechst ( 藍色 ) 的復合圖像，顯示對照細胞和用所選化合物處理的細胞 的分析軌跡。將 iCell 神經元鋪板 48 小時，用化合物處理 72 小時，然后固定并用 Hoechst (2 μM) 和 帶 AF 488 熒光的抗 TUJ-1 抗體 (1:100) 進行組合染色。圖像由 ImageXpress Nano 系統使用 10x Plan Fluor 物鏡進行 DAPI 和 FITC 通道拍攝。使用 CellReporterXpress 軟件中的 Neurite Tracing 分 析算法處理圖像。觀察到用指定化合物處理的神經元中破壞的神經突網絡和細胞死亡。​}

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