蛋白質羰基含量檢測試劑盒說明書
蛋白質羰基含量檢測試劑盒說明書
注意：正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。
貨號：YJ1270 規格：50T/24S
產品內容:
提取液：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。
紫外分光光度法
試劑一：粉劑 0.1g×3 支，4℃保存。（使用前根據樣品數，每支加 1mL 水溶解，每支為 10 個樣品用量）
試劑二：液體 10mL×1 瓶，4℃避光保存。試劑三：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。
試劑四：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。
試劑五：根據測定樣品量，將乙酸乙酯和無水乙醇等體積混合。（自備） 試劑六：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。
產品說明：
蛋白質羰基是多種氨基酸在蛋白質的氧化修飾過程中的早期標志，其含量高低表明蛋白質氧化損傷程度的大小，是衡量蛋白質氧化損傷的主要指標。
羰基與 2,4-二硝基苯肼反應生成紅色 2,4-二硝基苯腙，在 370nm 處有特征吸收峰。
自備實驗用品及儀器:
天平、恒溫水浴鍋、低溫離心機、漩渦震蕩儀、紫外分光光度計、1 mL 石英比色皿、蒸餾水， 無水乙醇和乙酸乙酯。
操作步驟：
一、樣品處理
組織樣品：稱取約 0.1g 組織樣品，加入 1mL 提取液，充分勻漿后于 4℃，5000rpm 離心 10min， 取上清，加入 0.1mL 試劑一，室溫放置 10min，4℃，12000rpm 離心 10min，取上清，然后取 20μL 測定蛋白含量，剩余的作為待測樣品。
二、測定步驟和操作表
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空白管 |
測定管 |
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樣品（mL） |
0.2 |
0.2 |
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試劑二（mL） |
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0.4 |
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試劑三（mL） |
0.4 |
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混勻，37℃避光反應 1h | ||
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試劑四（mL） |
0.5 |
0.5 |
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靜置 5min，4℃，12000rpm 離心 15min，棄上清，留沉淀 | ||
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試劑五（mL） |
1.0 |
1.0 |
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漩渦混勻，4℃，12000rpm 離心 10min，棄上清，留沉淀。重復 3 次 | ||
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試劑六（mL） |
1.0 |
1.0 |
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漩渦混勻，37℃溫育 15min，沉淀全部溶解后，4℃，12000rpm 離心 15min，取 上清 1mL 于石英比色皿，試劑六調零，測定 OD370 | ||
三、計算公式
1、按蛋白濃度計算：
蛋白質羰基含量（μmol/mg prot）=（OD370 測定管－OD370 空白管）÷（ε×d）×V÷(Cpr×V 樣品)
=（OD370 測定管－OD370 空白管）÷4.4÷Cpr；
2、按樣本鮮重計算：
蛋白質羰基含量（μmol/g 鮮重）=（OD370 測定管－OD370 空白管）÷（ε×d）×V÷(W×V 樣品÷V 提取)
=（OD370 測定管－OD370 空白管）÷4÷W
ε：蛋白質羰基消光系數，22 mL•μmol-1•cm-1；d：比色皿光徑，1cm；V：加入試劑六體積，1mL；
V 樣品：加入樣本體積，0.2 mL； V 提取：加入提取液及試劑一體積，1.1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL。W：樣品質量，g。
注意事項：
1. 試劑一使用之前根據要測定的樣品數現配，配置好后 4℃保存，若變為黑色，則不能使用。
2. 試劑二見光易分解，反應需嚴格避光。
