簡介

藥物有效性和安全性篩選成本的持續增加導致了對創新技術的需求，從而在藥物發現過程中更早地進行表征和特性的檢測分析。FDA正在制定化合物檢測的指導方針，以確保藥物的安全性，使得藥物無需因為不良反應而撤市， 例如阻斷心臟hERG通道，并導致像尖端扭轉型室性心律失常這樣的癥狀。這一方向被稱為全面的體外心律失常試驗或CiPA項目。誘導多能干細胞(iPSC)分化的心肌細胞因其用于評估對心臟功能和安全性的復合作用，在體外模型系統被廣泛使用。鈣信號振蕩的結果可以反映細胞內鈣離子濃度的變化， 從而可以使用鈣敏感染料如EarlyTox™熒光染料試劑盒進行信號的檢測。ScreenWorks®Pro軟件可以分析心肌細胞跳動峰值的頻率，峰值10%的振幅峰寬，以及其他參數以高通量篩選的方式來描述化合物影響心肌細胞。

干細胞公司CDI (Cellular DynamicsInternational) 已經開發了一種增強版的iPSCs分化的心肌細胞，其復蘇后恢復的速度比之前版本的iPSCs更快。這樣的改進使得在FLIPR Tetra 高通量實時熒光檢測分析系統上檢測化合物對跳動的心肌細胞鈣瞬變信號影響的工作流程縮短生長時間5 - 7天。圖1是示例的工作流程。本文中我們闡述了一些癌癥化合物的檢測，其中一些已知會影響hERG通道，其它化合物已知可以阻斷hERG通道。

優勢

• 縮短細胞培養時間，提高實驗的工作流程和質量
• 在藥物發現過程中更早地發現可能導致安全問題的化合物
• ScreenWorks Peak Pro軟件簡化數據分析

材料

• iCell® Cardiomyocytes2 試劑盒，包括細胞、鋪板培養基和維持培養基 (Provided byCellular Dynamics, International)
• 0.1% (w/v) 明膠
• 384孔黑壁底透多孔板 (Corning PN 3712)
• EarlyTox 心肌細胞毒性檢測試劑盒(Molecular Devices PN R8210)
• 測試化合物和DMSO (Sigma Aldrich)
• FLIPR Tetra 高通量實時熒光檢測分析系統(Molecular Devices)

準備iCell心肌細胞多孔板

在iCell心肌細胞使用指南的指導下，用0.1%的明膠包被384孔黑壁底透多孔板。iCell心肌細胞復蘇后以8000個細胞每孔的密度鋪在每孔25μL的培養基中。細胞在37°C、5% CO2、以及100%濕度條件下培養24小時。細胞形成單層并更換成維持培養基。細胞每隔一天更換一次維持培養基。在第5天，細胞開始同步跳動并可以用于實驗。

準備化合物板用于篩選檢測

為便于篩選檢測，化合物溶于100% DMSO配置成10 MM的母液。維持培養基稀釋母液至10-100 μM的檢測濃度。在使用FLIPRTetra系統檢測前，提前24小時將稀釋好的化合物溶液添加到每個孔中。DMSO在培養基中的最終濃度為0.15%(v / v)。濃度范圍從30或100μM對數稀釋的每個濃度的化合物進行兩次(n = 2)或三次(n = 3)的檢測。

使用FLIPR Tetra系統觀察鈣振蕩

實驗前24小時，以終濃度30μM開始的對數稀釋的各種化合物加入到iPSC 心肌細胞中。檢測之前兩個小時25μL體積的溶于維持培養基的2倍濃度的EarlyTox心肌細胞毒性檢測染料添加到每孔中，并在37°C、5% CO2條件下孵育。當細胞從培養箱取出后，鈣離子濃度的變化會隨著細胞的振蕩而變化，從而引起FLIPR Tetra系統所記錄的熒光信號的改變。在ScreenWorks工作軟件中的實驗方案和參數設置如表1所示。數據分析使用了ScreenWorks PeakPro軟件模塊，并在GraphPad Prism 6中繪制了圖形。

化合物對心肌細胞跳動的峰值參數的影響

用FLIPR Tetra系統在化合物添加24小時后進行鈣振蕩信號的檢測和記錄。iPSC2s與之前版本的iPSCs以相同的方式進行實驗，通過形成縫隙連接并同步振蕩，檢測到鈣敏感染料指示的峰值頻率。新型細胞比之前版本的細胞可提早4-5天用于檢測實驗，同時因其更低的污染風險和一個整體較短的時間周期并得到類似的結果，明顯改善了篩選的工作流程。用于實驗研究的抗腫瘤化合物包括：舒尼替尼、伊馬替尼和星形孢菌素(由于毒性原因而不作臨床使用的化合物)均是激酶抑制劑；白消安，一個烷基磺酸鹽；阿霉素，一種蒽環類藥物；依托泊苷，一種拓撲異構酶II抑制劑；而紫杉醇會干擾細胞管蛋白的生成。在化合物添加24小時后，一些鈣振蕩信號變化明顯異于對照組(圖2)。舒尼替尼的振蕩頻率較低，且在10%峰值高度的峰寬顯著大于對照組。其它具有相似鈣振蕩結果的抗癌化合物包括伊馬替尼(Imatinib)和星形孢菌素(Staurosporine)。這三種化合物與阻斷hERG通道有關。hERG基因編碼了鉀通道，有助于心臟跳動的恢復，其被阻斷有可能引起長QT綜合征或尖端扭轉型室性心律失常。紫杉醇、白消安和依托泊苷未知有hERG活性，且沒有類似的鈣振蕩減慢效應，也沒有10%峰值高度的峰寬增大的效應。量效曲線顯示，24小時暴露于阿霉素和舒尼替尼后峰值頻率顯著降低。紫杉醇也是一種不影響峰值頻率的化合物(圖3)。除抗癌化合物外，已知的hERG阻斷劑氟哌利多，一種抗精神病藥物和多巴胺受體阻斷劑；阿米替林，三環抗抑郁藥和5-羥色胺受體抑制劑；以及西沙必利，一種抗酸劑，均是已知的可導致長QT綜合征。此三種化合物也都在實驗中進行了檢測。在24小時內加入iPSC2s時，這三種化合物的峰值頻率都在降低以及10%峰值高度的峰寬增大(圖4)。在鈣振蕩測定中所測試的所有化合物的IC50值的總結如表2所示。

結論

iPSC2心肌細胞可實現在細胞解凍后的4 - 5天內，而不是10 - 14天進行實驗，從而改善了在FLIPR Tetra系統上進行篩選檢測的工作流程。ScreenWorks Peak Pro軟件模塊可以通過對鈣振蕩信號的記錄和分析，非常便捷地證實化合物對心肌細胞的效應，是藥物篩選過程中的有效工具。這樣的試驗可以在藥物開發早期進行，有助于在進入先導化合物開發流程之前發現可能對心臟產生不利或有益影響的化合物。

參考文獻：

1. Sirenko, Oksana, et al. “Phenotypic Assaysfor Characterizing Compound Effects onInduced Pluripotent Stem Cell-DerivedCardiac Spheroids.” ASSAY and DrugDevelopment Technologies, vol. 15, no. 6,2017, pp. 280‒296., doi:10.1089/adt.2017.792.
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3. Sirenko, Oksana, et al. “Assessment ofbeating parameters in human inducedpluripotent stem cells enables quantitative invitro screening for cardiotoxicity.”Toxicology and Applied Pharmacology, vol.273, no. 3, 2013, pp. 500‒507.,doi:10.1016/j.taap.2013.09.017.
4. “iCell Cardiomyocytes2 User Guide.”Cellular Dynamics International, Aug 2016.