在分子生物學(xué)研究中，DNA的序列分析是進(jìn)一步研究和改造目的基因的基礎(chǔ)。目前用于DNA測(cè)序的技術(shù)主要有Frederick Sanger發(fā)明的Sanger雙脫氧鏈終止法（Chain Termination Method）。快速DNA測(cè)序方法的出現(xiàn)極大地推動(dòng)了生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究和發(fā)現(xiàn)。

測(cè)序原理

利用一種DNA聚合酶來(lái)延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物，直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測(cè)定由一套四個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)構(gòu)成，每個(gè)反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長(zhǎng)的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對(duì)濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長(zhǎng)幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點(diǎn)，終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。

測(cè)序方法

基因分析儀(即DNA測(cè)序儀)，采用毛細(xì)管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳，應(yīng)用四色熒光染料標(biāo)記的ddNTP(標(biāo)記終止物法)，因此通過(guò)單引物PCR測(cè)序反應(yīng)，生成的PCR產(chǎn)物則是相差1個(gè)堿基的3'末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測(cè)序PCR產(chǎn)物可在一根毛細(xì)管內(nèi)電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測(cè)序的精確度。

由于分子大小不同，在毛細(xì)管電泳中的遷移率也不同，當(dāng)其通過(guò)毛細(xì)管讀數(shù)窗口段時(shí)，激光檢測(cè)器窗口中的CCD(charge-coupled device)攝影機(jī)檢測(cè)器就可對(duì)熒光分子逐個(gè)進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機(jī)上同步成像，分析軟件可自動(dòng)將不同熒光轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列，從而達(dá)到DNA測(cè)序的目的。分析結(jié)果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。

測(cè)序設(shè)備

DNA測(cè)序儀(3730xl DNA Analyzer)，性能特點(diǎn)，自動(dòng)化程度高，提供連續(xù)、無(wú)需監(jiān)控的操作，自動(dòng)灌膠、上樣、電泳分離、檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析，可連續(xù)運(yùn)行24小時(shí)無(wú)需人工干預(yù)。樣品分析量大，一束毛細(xì)管可同時(shí)對(duì)96個(gè)樣品進(jìn)行全自動(dòng)分析，一天可完成數(shù)百個(gè)樣品的測(cè)序或片段分析工作。

先進(jìn)的熒光檢測(cè)系統(tǒng)，采用光柵分光，CCD攝像機(jī)成像技術(shù)，實(shí)現(xiàn)多色熒光同時(shí)檢測(cè)，與傳統(tǒng)的濾鏡及光電倍增管的檢測(cè)方式相比，光柵及CCD的優(yōu)勢(shì)在于更新熒光化學(xué)時(shí)無(wú)需更換任何硬件設(shè)備。從激光光源發(fā)出的光線被光學(xué)元件分成兩股，96根毛細(xì)管被一束激光同時(shí)從兩面照射，有效提高熒光檢測(cè)靈敏度和均一性。

測(cè)序流程