Theresa Lynch 1 ; Kate Comstock 2 ; Jack Cunniff 2
1 Gilead Sciences, 333 Lakeside Dr, Foster City, CA;  2 Thermo Fisher Scientific,
355 River Oaks Parkway, San Jose, CA

前言

活性藥物成分（API）和成品藥的雜質分析是藥物研發中不可或缺的一環。雜質的化學結構信息在評估毒性、改進合成途徑，以及根據目標成藥選擇最佳劑型至關重要。為保證藥效與消費者的安全，世界各國的監管機構都制定了藥物雜質分析的指引，清楚說明基于日服用量、使用時間，和藥物靶標的限量標準。

LCMS 已經成為最常用的未知雜質分析技術。為了能在大量母藥中識別并表征痕量雜質，具有高靈敏度、高掃描速度，并且能進行多級質譜分析（MS n ） 的質譜儀必不可少。在本研究中，Sigma-Aldrich 所售的研究級阿德福韋酯（adefovir dipivoxil，ADP） 被用來作為模型化合物進行 API雜質分析。ADP 是廣泛用于慢性乙肝病毒感染的一種抗病毒處方藥。本研究中使用的 LCMS 系統由 Thermo ScientificAccela TM UHPLC以及 Velos Pro TM 雙壓線性離子阱質譜儀構成。碎片信息通過結合應用 CID 與 Trap-HCD 解離技術獲得。數據處理通過軟件 Mass Frontier TM 完成。

分析方法

材料與試劑
阿德福韋酯（Adefovir dipivoxil，CAS# 142340-99-6）從 Sigma-Aldrich 購得，產品號 A9730。
乙腈和水 （Fisher）；乙酸銨（Sigma-Aldrich，產品號73594-25G-F）；甲酸（Sigma-Aldrich，產品號 33015-
500ml）。

樣品制備
  ADP溶液，0.5mg/mL，用 1 ml 20 : 80 的乙腈和水混合溶劑溶解 0.5mg ADP 獲得。

HPLC方法
  HPLC系統：Thermo Accela 1250 泵，開放式 Accela 自動進樣器及 Accela PDA
  色譜柱： Hypersil GOLD C18 2.1×150 mm，3 µM，
  Thermo Scientific 產品號 071399
  柱溫：35 ℃
  流速：0.5 ml/ 分鐘
  進樣體積：8 μl
  流動相：A – 水，B – 乙腈，C - 100 mM 乙酸銨，用乙酸調至 pH 5
  梯度洗脫：
           時間（min） A%   B%   C%
                 0    80   10   10
               12.0   20   70   10
               14.0   20   70   10
               14.1   10   80   10
               15.0   10   80   10
               15.1   80   10   10
               19.0   80   10   10

質譜方法
  質譜儀：配有 HESI-II 離子源的 Velos Pro TM 雙壓線性離子阱
  離子化條件：電噴霧， 正離子模式
    1. 全掃模式 m/z 120-1000 amu/ Top5 dd MS/MS，HCD NCE 35%
    2. 全掃模式 / 按母離子列表 dd MS 2 / TOP 3 ddMS 3 ,CID/Trap-HCD NCE 20%
        a. CID MS 2 / CID MS 3
        b. CID MS 2 / HCD MS 3
        c. HCD MS 2 / CID MS 3
        d. HCD MS 2 / HCD MS

結果與討論

I. 全掃—Top5 HCD dd MS/MS 與“FISh”
ADP 雜質譜分析流程由兩次連續的 LCMS 實驗構成。分析目標是為雜質鑒定和結構解析收集盡可能多的信息。
第一個 MS 實驗包括全掃描和后續的 Top5 HCD 數據依賴MS/MS 掃描（圖 1）。 接下來，數據通過 Mass Frontier 當中的 Fragment Ion Search（碎片離子檢索，FISh）算法進行處理，這是一個新穎的進行雜質檢出及鑒定的方法，主要基于母離子解離模式的比較（圖 2a，b）。與母藥擁有相同碎片的成分會被“FISh”識別出來，見圖 3。

II.Trap-HCD/CID MS 2 和 MS 3 為未知化合物的結構解析
提供豐富的碎片信息進一步的結構信息通過結合母化合物列表、使用 Trap-HCD和 CID 解離組合進行 MS 3 實驗獲得。當歸一化的碰撞能量水平相同時，Trap-HCD 比 CID 生成的碎片譜圖信息更豐富。Trap-HCD 沒有低質量數歧視效應，見圖 4。CID MS n 能夠提供步進的裂解信息，對結構解析非常有價值，見圖 5，6。

- 全掃,CID dd MS² （設定母離子列表），然后對前三的MS² 碎片離子進行 HCD MS³
- 全掃,CID dd MS² （設定母離子列表），然后對前三的MS² 碎片離子進行 CID MS³
- 全掃,HCD dd MS² （設定母離子列表），然后對前三的MS² 碎片離子進行 CID MS³
- 全掃,HCD dd MS² （設定母離子列表），然后對前三的MS² 碎片離子進行 HCD MS³





根據豐富的 HCD、CID MS 2 和 MS 3 碎片信息（見圖 7），對鑒定出的雜質化合物進行了結構預測。每個雜質組分的精確質量數和元素組成通過臺式 Orbitrap Q Exactive TM 質譜儀的高分辨數據確認。

結論
兩種解離技術—Trap-HCD 和 CID—被用來表征市售研究級阿德福韋酯（adefovir dipivoxil）樣品中的十三種低含量雜質。當歸一化的碰撞能量水平相同時，Trap-HCD 比 CID 生成的碎片譜圖信息更豐富。Trap-HCD 不存在低質量歧視效應。另一方面，CID 能夠提供逐級裂解信息和 MSn 譜圖，對于闡明子結構關聯非常有價值。本研究的結果證明，結合數據后處理軟件使用這兩種互補的解離方式能夠出色完成雜質鑒定與結構解析，提高了未知雜質分析的速度與可靠性。