1. 確定分離目的      

確定你的應用是否要求高分離度、短分析時間、高靈敏度、長柱壽命，低的操作成本等等。

2. 評估分析物的化學性質      

評估分析物的化學性質，諸如化學結構、溶解性、穩定性等等。

3. 選擇合適的色譜柱      

了解色譜填料的物理和化學性質。

A填料基質

硅膠基質：純度高成本低，強度大，化學修飾容易， 但pH值范圍有限。大多硅膠基質填料在pH2-8之間穩定，但經過特殊修飾的硅膠鍵合相可以穩定在pH1.5-10。
聚合物基質：應用pH值范圍寬，溫度穩定（高溫可以達到80度以上），機械強度小。

B顆粒形狀

大多現代HPLC填料都是球形顆粒，但有時是不規則的顆粒。球形顆粒提供較低的柱壓、較高的柱效和穩定性以及較長的柱壽命在使用高粘度的流動相時；不規則顆粒有較大比表面積和相對低廉的價格。

C顆粒粒徑

粒徑越小柱效越高、分離度越高，但同時會導致較高柱壓降。選擇1.5-3µm的填料以解決一些復雜樣品,UPLC可以使用1.5µm的填料；另外10µm或更大粒徑的填料用作半制備或制備柱。

D 含碳量

含碳量指的是硅膠表面鍵合相的比例，與比表面積和鍵合覆蓋度等有關。高含碳量提高柱容量、分辨率及分析時間，用于要求高分離度的復雜樣品；低含碳量分析時間短、展現不同的選擇性，用于快速分析簡單樣品及需要高含水流動相條件的樣品。一般C18的含碳量在7-19%不等。

E孔徑和比表面積   

HPLC吸附介質是多孔的顆粒，絕大多數的反應表面于孔內。因此，分子必須進入孔內才能被吸附和分離。
孔徑和比表面積是相輔相成的兩個概念。孔徑小比表面積大，反之亦然。比表面積大，增加樣品與鍵合相之間的反應，增加保留,上樣量和復雜成分的分離度；比表面積小，平衡時間快，適合梯度分析。

F孔容和機械強度

孔容，又稱“孔體積”。 指單位顆粒的空隙體積大小。它能很好的反應填料的機械強度。孔體積大的填料相對孔體積小的填料機械強度要略弱。孔體積為1.5mL/g  或更小的填料大多用于HPLC分離，而孔體積大于1.5mL/g  的填料使用于尺寸排阻色譜和低壓色譜。

G封端封端

封端能夠降低極性堿性化合物因為與裸露的硅醇基相互作用而產生的拖尾峰。不封端鍵合相相對封端鍵合相會產生不同的選擇性，尤其是極性樣品。

色譜填料分類（鍵合相）

1 s硅膠柱適用于能溶于有機溶劑的低分子量化合物的分離。硅膠柱上的分離與樣品中化合物的官能團方
位、類型和數量有關。在制備色譜技術中，正相色譜技術有很大優勢，因為純化以后的樣品只需要蒸發掉溶劑即
可得到純凈化合物，不象反相色譜那樣需要費時的冷凍干燥。

2 ODS/C8/C4等反相柱

ODS使用單官能團鍵合劑在優化的條件下達到高密度鍵合覆蓋率的一種十八烷基鍵合相硅膠吸附劑，耐用的小分子HPLC柱，，C18柱常和水/甲醇或者水/乙腈流動相結合使用，對于疏水性不同的小分子，蛋白質和肽類等，具有出色的分離能力 。C8與C18色譜柱相同，也是靠疏水性相互作用的機理分離樣品，但是保留能力減弱。當樣品極性太強或者疏水性太強而無法在C18柱上進行色譜分析時，C8柱是一個很好的選擇。一些極性化合物在C8柱上能有更好的表現，由于C8鍵合相良好的表面覆蓋率，像維生素、抗生素和堿性藥物通常在C8柱上的分離要比C18柱好，而且峰形更加對稱。

3NH2是一種氨丙基鍵合硅膠吸附相，既能用于正相分析，又能用于反相分析。氨基固定相的選擇性與
C18相比，有很大差別，使得它對那些極難分析的極性化合可以達到理想的分析結果。另外，氨基柱與離子凝
膠柱相比，對糖類化合物表現出更高的分離效率。此類應用中的典型流動相是乙腈/水。在正相模式下的分離
類似于未鍵合的硅膠，但是梯度平衡的時間更短，壽命更長。

4 二苯基

適用于含有雙鍵和芳香基團的化合物。與C18和苯基已烷鍵合相相比，不是依靠疏水保留機理，二苯基鍵合相主要是依靠化合物的π-電子結構的不同來獲得分離。如果您需要在分析中提高芳香族和雙鍵化合物的選擇性，提高分離度以及提高樣品通量。

5氰基柱

氰丙基鍵合硅膠吸附相，它的獨特之處在于能同時用于正相和反相分離模式。當使用含水的有機流動相時，分析物的洗脫順序和反相模式一致：極性化合物洗脫快，非極性化合物則被更多的保留。因此氰基柱可以分析那些對C18柱來說疏水性太強而且在有機溶劑中溶解性不好的化合物。氰基柱作為正相柱使用時，分離化合物的原理是基于極性相互作用。
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