如何隨心所欲的做好免疫組化？

免疫組化（Immunohistochemistry) 至今也有八十余年的歷史了，從 1930 年免疫組化的理論被提出討論，一直到 1941 年以帶有熒光色素的抗體，成功地觀察到組織中肺炎雙球菌抗原的存在，至此之后不斷對于方法改良創新，也就形成了我們實驗中才使用的免疫組化這門技術，先來淡談一下免疫組化為何八十幾年來還是都是實驗室中的重要的實驗項目之一。

人體的器官是由最小單位細胞所組成的，一般實驗不論是從細胞研究蛋白或是基因，我們往往都會想知道通過最小單位的細胞放大到組織后，我們所研究的蛋白或是基因會是以何種方式的呈現在組織上呢？這時不論是研究蛋白 (免疫組化 Immunohistochemistry) 或是研究基因（原位雜交法 chromogenicin situ hybridization，CISH) 就不難理解這兩門技術的重要性了。

我們首先針對實驗來進行討論，一般做組化的同仁一定會遇到的頭痛問題，這個問題也就是背景 (background)，背景的產生來至四面八方，從組織前處理，抗原修復，免疫阻斷到最后呈色，以上這些都是有可能會造成背景的產生，所以到此撇開人為因素不談，我們慎選一組好的免疫組化的套組對整體的實驗是非常的重要。

我們一一的來討論背景是如何產生的，從組織前處理來說，我們最開始取得組織，我們會經過一個步驟(灌流)，為何要灌流呢？我們首先要知道我們免疫組化最常使用的方法就是 HRP 呈色。那我們把鏡頭拉回我們的組織，我們要知道組織中富含最多 HRP 的就是我們的血球，從這邊大概就可以知道我們如果沒有把血球處理干凈的話,很容易造成在后續呈色的時候，會發現血球沒有清除干凈的地方就會產生我們所謂的背景了，另一個也是清除組織里面血球的方法，也就是我們免疫組化中一定會使用的過氧化酶去除劑，以上這兩個方法都是有效去除我們組織上面的 HRP。

另一個步驟也是組化實驗中一定會使用到但是往往會忽略的一步：抗原修復，為什么要做抗原修復呢？原因是我們取得新鮮檢體時通常都會進行甲醛固定這個步驟，而甲醛固定的這個過程中會形成醛鍵，醛鍵是會封閉抗原的決定族，這種化合物封閉了抗原，一但抗原被封閉后，我們在進行抗體接合時，就會因為抗體無法辨識抗原因而造成偽陰性的情況，這也就是為什么要做抗原修復的原因，抗原修復的方法有很多種，目前最常使用的有以下三種檸檬酸緩沖液（Citrate），EDTA緩沖液，酵素（Enzyme），通常我們最常使用的是檸檬酸緩沖液，主要是它可以進行的抗原修復抗原的種類涵蓋的比較廣，但是還是會有一些抗原的位置是檸檬酸緩沖液無法處理的，所以進行實驗時選擇對的抗原修復液，也是很重要的一門功課。

再來談到在實驗中會使用的免疫阻斷劑，免疫阻斷劑的配方有很多種，但是其實每一種配方可能只能針對特定的背景進行去除，這時選擇復合性的免疫阻斷劑會對于實驗更有幫助，其實我們會發現大部分進行組化實驗的時候為什么都是以老鼠或是兔子的檢體背景最多呢？其實這個問題不難回答，我們翻翻自己冰箱的抗體,大多數的物種就是來自于老鼠或是兔子，也因為這個緣故而造成在進行動物實驗時會有背景的產生，所以免疫阻斷劑的選擇變成整體實驗非常大的一個關鍵。

最后我們討論到的呈色，不過這個跟實驗法則比較相關了，我們所使用的 DAB 或是 AEC 呈色，他們的原理是以沉淀的方式進行顯色，這也意味著我們呈色的實驗越長顏色就會越深，所以對于呈色的時間點拿捏也是完成整個免疫組化非常重要的一個課題。

綜合以上討論的項目，做組化并不困難，其實魔鬼藏在細節里，我們只要針對每個環節每個可能產生背景的部分更細心去進行處理，免疫組化就是一項很簡單的實驗了。

再來我們討論一項我們進行免疫組織染色實驗設計中會遇到的問題，一般我們設計實驗要研究的蛋白絕對不會有一種，我們一定會看各式各樣的蛋白讓我們研究主題這個故事更完整，但是一般我們進行組化只能染一種可見光的顏色，那如果我們想同時觀察兩種蛋白在組織上面是相互抑制或是相互增長等等的表現，我們勢必會使用一種染色方法 (雙染 Double stain)，相信雙染在座的各位一定也不陌生，但是你們熟悉的往往都是熒光的雙染，這時就會有疑問了，為什么只能做熒光呢？主要是熒光雙染我們是可以利用激發光的不同分開來拍攝，最后再進行圖片的合成，但是這也衍生出其它的問題來，第一個 蛋白的位置，我們最開始使用免疫組化不就是為了想看我們研究的蛋白是在什么地方表現的嗎？但是如果使用熒光染色就會明白只有我們蛋白表現的位置會發光，而其它的部分全都是黑的，這么一來其實就很難去討論它表現在組織的位置是否是正確的，另一個問題 照片的合成，我們以雙染來探討，我們會先拍 DAPI 也就是核的部分，再來是我們研究的　A 蛋白　跟 B 蛋白，整個拍完之后再利用軟件進行合成，第一點時間會耗費很久，第二點是合成的時候萬一背景沒有處理的很干凈因而產生一些非專一性結合的表現，這時同時使用三張圖片合成一張，這個結果圖可能會變得非常不好進行數據的判斷。

其實大家心里會有一個疑問，為什么不做可見光呢？其實依照以前的技術是真的比較不好進行可見光的雙染，主要還是因為可見光的免疫組化同時看兩種抗體如果沒處理好反而會有很臟的背景，相信有想做的同仁一定都遇過上述的問題，不過近年來隨著技術跟方法的提升，我們已經突破會造成背景的問題了，如此一來針對上述熒光所帶來的問題，例如我們想在同一個視野下看到兩種蛋白的表現還有沒有背景的產生，通通會因為有這項新的技術迎刃而解了，以前進行雙染有些時候是沒辦法做可見光才進行熒光的，不過這個問題已經解決，相信可見光的免疫組化雙染，這個新技術可以為大家的研究更上一層樓。

最后要為大家介紹是最近研究非常熱門的技術（原位雜交法chromogenicin situ hybridization，CISH）這個技術說新其實也不新，早在 20 世紀 80 年代末就開始發展這門技術，不過當時所研究的重點都放在 DNA 上，但是也因為技術門坎高加上成功率也不那么的穩定，造成這門技術我們在書上常看到但是實際應用其實不廣，那么為什么會說是最近開始熱門起來呢？其一、隨著生物科技產業蓬勃發展，技術與學術不斷推陳出新，早期遇到的問題都可以輕易破解，其二最近微小 RNA（Micro RNA）變成了一個主流的研究方向，早期我們不斷的研究著蛋白的表現路徑，隨著學術知識不斷的更新，我們從下游產物蛋白質不斷的往上追尋，終于找到了比較前面的源頭也就是微小 RNA，最早我們利用實時PCR（Realtime PCR）來進行測定，但是測定出來的結果都是一長串的數據分析，人的求知欲是無限的，隨著研究時間越久人們的求知欲越高，于是回到最一開始我們提到的問題，如果有辦法在組織上看到微小 RNA 的表現不知道會是什么情形呢，就是這個想法讓原本沉寂已久的原位雜交法瞬間變成了學術及研究界中的新星，這個方法滿足了我們所有的求知欲，隨著技術改進，原位雜交法實驗步驟變得容易，研究的方向從最早的 DNA，RNA 到最近的微小 RNA 都可以進行研究，而另一個更好的優點則是她并不受蛋白質裂解的影響，綜合以上優點不難理解為什么大家爭先恐后的要使用這門技術了。

組織研究是在學術研究上不可抹滅及取代的一塊研究領域，我們將病理組織相關研究技術不斷的研究及推陳出新，一直秉持著走在研究技術的最前端，在將來我們要把目前最火紅的兩門技術原位雜交法及免疫組化雙染同時進行在同一個組織上，也就是意味著我們一個組織可以同時看到基因的表現也可以同時觀察到蛋白質的表現，相信這門新興的技術會再一次把病理組織這門技術推上更高的巔峰。

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