Ｄ －絲氨酸對杏仁核區 ＮＭＤＡ 受體恐懼消退的作用

【摘要】 目的 探討條件性恐懼與消退模型小鼠杏仁核區 Ｄ－絲氨酸代謝酶的變化及外源性 Ｄ－絲氨酸和ＮＭＤＡ 受體阻斷劑 ＭＫ－８０１ 對恐懼消退的影響及 Ｄ－絲氨酸抗焦慮作用的可能機制。 方法 （１）將 Ｃ５７ 小鼠隨機分為空白對照組、條件性恐懼組、消退訓練組、消退檢測組，每組 ６ 只，對照組不給予聲音及電刺激，其余每組分別進行條件性恐懼、消退訓練、消退檢測等相應的實驗步驟后取雙側杏仁核區組織提取蛋白進行 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 檢測。（２）將 Ｃ５７ 小鼠隨機分為 ３ 組：對照組（Ｆ）、Ｄ－絲氨酸組（Ｆ）、ＭＫ－８０１組（Ｆ），每組 ８ 只，于消散訓練前 １ ｈ分別腹腔注射生理鹽水、Ｄ－絲氨酸 １０００ ｍｇ ／ ｋｇ 及ＭＫ － ８０１ ０暢 １ｍｇ／ ｋｇ。（３）Ｃ５７ 小鼠隨機分為 ３ 組：對照組（Ｘ）、Ｄ－絲氨酸組（Ｘ）、ＭＫ － ８０１ 組（Ｘ），每組 ８ 只，于消散訓練前 １ ｈ 分別杏仁核區注射生理鹽水、Ｄ－絲氨酸 ４μ ｇ ／ 側、ＭＫ － ８０１ ０.１ μ ｇ／側。（４）應用高架十字迷宮探討 Ｄ －絲氨酸對焦慮行為的影響。 結果 （１）與空白對照組比較，消退訓練組及消退測試組杏仁核區絲氨酸消旋酶的表達下降，Ｄ －氨基酸氧化酶表達上調。（２）Ｄ －絲氨酸組（Ｆ）木僵行為低于對照組（Ｆ），ＭＫ － ８０１ 組（Ｆ）高于對照組（Ｆ）及 Ｄ －絲氨酸組（Ｆ）（P ＜ ０.０５）。 （３）Ｄ －絲氨酸組（Ｘ）的木僵行為少于對照組（Ｘ），ＭＫ － ８０１ 組（Ｘ）多于對照組（Ｘ）和 Ｄ －絲氨酸組（Ｘ）（P ＜ ０.０５）。 （４）Ｄ －絲氨酸組小鼠在高架十字迷宮中開放臂時間百分比高于對照組（P ＜ ０.０５）。結論 Ｄ －絲氨酸的抗焦慮作用很可能與激活杏仁核區 ＮＭＤＡ 受體促進恐懼記憶消退有關。
【關鍵詞】 杏仁核；Ｄ－絲氨酸；恐懼消退

焦慮癥是以廣泛和持續性焦慮不安或反復發作的驚恐為主要特征精神心理性疾病。 恐懼消退受損是焦慮癥狀持續存在的主要原因。 ＮＭＤＡ 受體是谷氨酸受體的亞型，大量研究表明 ＮＭＤＡ 受體在恐懼消退中起著重要的調節作用。 Ｌ －絲氨酸在絲氨酸消旋酶（ｓｅｒｉｎｅ ｒａｃｅｍａｓｅ，ＳＲ）的作用下轉化為 Ｄ －絲氨酸，Ｄ －氨基酸氧化酶（ Ｄ －ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ，ＤＡＡＯ）是 Ｄ －絲氨酸的主要代謝酶。 ２０１３ 年 ６ 月至 ２０１４ 年 ９ 月，本研究通過條件性恐懼與消退模型小鼠杏仁核區 Ｄ －絲氨酸代謝酶的變化及外源性 Ｄ －絲氨酸和 ＮＭＤＡ 受體阻斷劑 ＭＫ － ８０１ 對恐懼消退的影響，研究 Ｄ －絲氨酸抗焦慮作用的可能機制。

１ 材料與方法

１．１ 實驗藥物 Ｄ －絲氨酸、ＭＫ － ８０１、ａｎｔｉ －ＳＲ ａｎｔｉ-ｂｏｄｙ、ａｎｔｉ －ＤＡＡＯ ａｎｔｉｂｏｄｙ、β－ａｃｔｉｎ、二抗均購買于Ｓｉｇｍａ 公司。

１．２ 實驗動物及分組 Ｃ５７ＢＬ／ ６Ｊ 雄性小鼠（Ｃ５７）７２只，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供），９ ～１０ 周齡，體重 ２０ ～２５ ｇ，飼養于標準環境（環境溫度２４ ～ ２７℃，自由獲得食物和水），光照周期 １２ ｈ。 （１）實驗１：將 Ｃ５７ 小鼠隨機分為 ４ 組：空白對照組、條件性恐懼組、消退訓練組、消退檢測組，每組 ６ 只，空白對照組不給予聲音及電刺激，其余每組分別進行相應的實驗步驟按１.３ 進行，結束后分別在模型后 １ ｈ 用取雙側杏仁核區組織提取蛋白進行 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 檢測。 （２）實驗 ２：將 Ｃ５７ 小鼠隨機分為 ３ 組：對照組（Ｆ）、Ｄ －絲氨酸組（Ｆ）、ＭＫ － ８０１ 組（Ｆ），每組 ８ 只，于消散訓練前 １ｈ 給藥，分別腹腔注射生理鹽水、Ｄ －絲氨酸 １ ０００ ｍｇ／ｋｇ 及 ＭＫ－８０１ ０.１ ｍｇ ／ ｋｇ。 （３）實驗 ３：將 Ｃ５７ 小鼠隨機分為 ３ 組：對照組（Ｘ）、Ｄ －絲氨酸組（Ｘ）、ＭＫ － ８０１組（Ｘ），每組 ８ 只，于消散訓練前 １ｈ 給藥，分別杏仁核區注射生理鹽水、Ｄ－絲氨酸 ４ μ ｇ ／ 側、ＭＫ －８０１ ０.１μ ｇ／ 側。
１．３ 條件性恐懼及消退訓練模型的建立 實驗裝置為底邊有導電的小鐵柱有機塑料容器（由上海欣軟信息科技有限公司提供，型號XR-XC404）。 第 １ 天實驗為恐懼學習記憶形成，將小鼠放入容器內適應 ３ ｍｉｎ。 然后連續進行 ４ 組訓練，每組訓練包括：３０ ｓ 的聲音刺激（８０ ｄＢ），聲音刺激的最后 ２ ｓ 給電流刺激（０.５ ｍＡ），每組間隔 ３０ ｓ。 第 ２ 天為恐懼記憶消散訓練，將小鼠放入另一個貼有黑白相間的紙條有機塑料容器內。 然后連續進行 ４ 組訓練，每組訓練包括：３０ ｓ 的聲音刺激（８０ ｄＢ），間隔 ３０ ｓ。 第 ３ 天實驗為恐懼記憶消散檢測，容器及刺激與第 ２ 天相同。 觀察小鼠的木僵行為。每只小鼠實驗結束時，用 ７０％乙醇清洗實驗設備 。
１．４ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 檢測杏仁核區組織提取蛋白 取小鼠斷頭，利用振蕩切片機切冠狀面腦片，厚度 ４００ μ ｍ，置入事先通氧飽和的人工腦脊液中孵育 １ ～ １暢 ５ ｈ。 在體視顯微鏡下分離杏仁核裝入 ＥＰ 管，提取蛋白，應用ＢＣＡ 法蛋白含量測定。 按 ３０ μ ｇ 蛋白量上樣。
１．５ 杏仁核區安置套管１０％水合氯醛麻醉小鼠后，用立體定位儀固定頭部。 以前囟為基點，按照杏仁核定位的腦區坐標 （ 前囟向后 １.５ ｍｍ，中線旁開 ３.４ｍｍ，向下 ３.５ ｍｍ），將針管按照定位坐標的深度插入到需要的腦區，固定針管并封閉，將其放入籠中休息４ ～ ５ ｄ。
１．６ 高架十字迷宮實驗 在消退訓練檢測后 ３ ｈ 將小鼠放在迷宮的中央區。記錄 ５ ｍｉｎ 內小鼠的運動情況，分析指標：進入開放臂時間／ 總的時間。實驗結束后，用７０％乙醇清洗高架十字迷宮儀器（實驗儀器由上海欣軟信息科技有限公司提供，型號：XR-XG201）。
１．７ 統計學方法 采用 ＳＰＳＳ １８.０ 統計軟件，行單因素方差分析（ｏｎｅ －ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）。 兩兩比較采用 ＬＳＤ －t檢驗。

３ 討論
焦慮癥的最主要特點之一是恐懼記憶持久存在，難以遺忘。杏仁核是調節動物情緒的核心區域。大量研究表明，杏仁核在焦慮癥的發生過程中起到決定性的作用。杏仁核參與恐懼記憶的形成、維持和消散。Ｄ－絲氨酸在一些哺乳動物腦區如海馬、杏仁核等含量豐富。 研究表明，Ｄ－絲氨酸是內源性調節ＮＭＤＡ 受體重要的共激活分子。它可通過作用于ＮＭＤＡ受體甘氨酸結合位點增加 ＮＭＤＡ 受體活性，從而影響消退記憶。 有學者發現通過條件反射性恐懼訓練的動物，其行為表現與焦慮癥患者的癥狀相似，是研究焦慮及學習記憶經典的動物模型，高架十字迷宮是進行焦慮研究的新方法，結果可靠。通過研究條件性恐懼及消退小鼠杏仁核區 Ｄ－絲氨酸代謝酶的變化，可間接了解杏仁核區Ｄ－絲氨酸濃度變化。本實驗發現，消退訓練組（第 ２ 天）及消退測試組（第 ３ 天）小鼠杏仁核區 ＳＲ 的表達均下降，ＤＡＡＯ 水平升高，表明恐懼記憶的形成影響杏仁核Ｄ－絲氨酸代謝變化。但條件性恐懼組（第 １ 天）小鼠杏仁核區ＳＲ 的表達與對照組比較差異無統計學意義，可能與早期恐懼記憶尚未影響杏仁核區 ＳＲ 的蛋白合成有關。

恐懼消退受損是焦慮癥狀持續存在的主要原因，促進恐懼記憶消散是藥物研究的重要靶點。因此，我們研究 Ｄ－絲氨酸抗焦慮作用是否是通過激活 ＮＭＤＡ受體促進恐懼記憶消散來實現的。 通過腹腔注射外源性 Ｄ－絲氨酸或 ＮＭＤＡ 受體阻斷，應用恐懼消退測試、高架十字迷宮觀察小鼠恐懼消退或焦慮行為的變化，研究發現腹腔注射外源性 Ｄ－絲氨酸鼠木僵行為顯著少于對照組，而腹腔注射 ＭＫ－８０１ 阻斷劑鼠的木僵行為高于對照組。在高架十字迷宮中，Ｄ－絲氨酸組進入開放臂的時間百分比高于對照組，而 ＭＫ－８０１組進入開放臂的時間百分比低于對照組。上述研究結果表明，Ｄ－絲氨酸可以促進恐懼消退，且其抗焦慮作用是通過激活 ＮＭＤＡ 受體促進恐懼記憶消退來實現的。

近些年的研究顯示杏仁核參與調控恐懼記憶的形成、鞏固和消散，因此，我們進一步研究 Ｄ－絲氨酸抗焦慮作用是否是通過激活杏仁核區的 ＮＭＤＡ 受體來實現。通過杏仁核區立體定位安置套管，微量注射外源性 Ｄ－絲氨酸或者 ＮＭＤＡ 受體阻斷 ＭＫ－８０１，應用恐懼消退測試觀察小鼠恐懼消退或焦慮行為的變化。研究發現杏仁核區微量注射外源性 Ｄ －絲氨酸組的木僵行為均少于對照組，而 ＮＭＤＡ 受體阻斷劑 ＭＫ－８０１組的木僵行為高于對照組。 表明 Ｄ－絲氨酸抗焦慮作用與激活杏仁核區 ＮＭＤＡ 受體促進恐懼記憶消退有關。