優(yōu)點

• 一定時間內(nèi)同時檢測幾種不同信號

• 利用多種算法和曲線擬合全面分析數(shù)據(jù)

• 使用工作流程編輯器建立一套簡單的實驗方案

簡介

在一段時間內(nèi)同時檢測幾種不同信號的輸出尤其在研究蛋白或化合物對細胞生長或基因表達作用方面很有幫助。在本應(yīng)用指南里，我們利用SoftMax® Pro 7版本軟件同時來檢測細胞生長(光吸收)和蛋白表達(熒光)。

在細菌中，lac操縱子是一種由編碼ß-半乳糖苷酶的啟動子調(diào)控的基因群。將一個蛋白表達序列插入到含有l(wèi)ac操縱子的質(zhì)粒中并轉(zhuǎn)染細菌，可使這一轉(zhuǎn)化細菌來表達感興趣的蛋白。通常情況下，lac啟動子是被變構(gòu)抑制的，但是在異丙基-ß-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)存在下，阻遏物從啟動子序列釋放引起感興趣蛋白的的表達。相反，如果IPTG過量，細胞會轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)先將胞內(nèi)物質(zhì)用于蛋白表達并且細胞生長也會受到阻礙。

通過同時檢測細胞密度和蛋白表達，我們展示了大腸桿菌(E.coli)是如何響應(yīng)系列稀釋的IPTG的。

材料

 ·  SpectraMax® M2多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices)

 ·  Luria Broth (LB)培養(yǎng)基(Teknovacat.#L8080)

 ·  氨芐青霉素(Teknova cat.#A9525)

·  1 M IPTG (Teknova cat. #I3431)

·  96-孔透明平底聚苯乙烯多孔板(Greiner cat. #655-161)

·  含有pBbE5-RFP的E. coli質(zhì)粒(Keasling Lab)

方法

包含pBbE5-RFP質(zhì)粒(圖1)的大腸桿菌(E. coli)由JayD.Keasling2教授提供。大腸桿菌(E. coli)菌株培養(yǎng)在含有100μM氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，生長到OD600為0.3時，再將100μL的大腸桿菌(E.coli)轉(zhuǎn)移到透明96孔板中。用起始濃度500 μM的IPTG兩倍系列稀釋來處理大腸桿菌(E.coli)。0 μM IPTG和只含培養(yǎng)基的對照也分別進行檢測。

微孔板放入SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀中3 2 °C孵育并用動力學(xué)法檢測。利用SoftMaxPro7軟件的工作流程編輯器，創(chuàng)建包括光吸收和熒光兩種檢測方法的動力學(xué)循環(huán)，讀數(shù)之間震板10秒，參數(shù)設(shè)置如表1。循環(huán)每10分鐘1次，共24小時。使用SoftMax Pro7版本軟件對產(chǎn)生的兩種檢測方法的動力學(xué)數(shù)據(jù)進行分析。

結(jié)果

光吸收和熒光檢測的動力學(xué)曲線分別由圖2和圖3所示。圖2中，不斷增加IPTG濃度導(dǎo)致OD600下降，意味著對細菌生長起反作用。圖3中，提高IPTG濃度不會引起紅色熒光蛋白(RFP)表達量的增加。相反，提高IPTG濃度會導(dǎo)致總RFP表達量的減少。這一減少可能是因為細菌生長停滯造成的。

在圖4中，對光吸收和熒光數(shù)據(jù)做處理以計算曲線下的面積(AUC)。采用SoftMaxPro7版本軟件進行分析并總結(jié)出IPTG對細胞生長和蛋白表達的影響。IPTG對熒光的影響在除500 μM濃度外的其他所有濃度中效果都是相似的，即提高IPTG濃度導(dǎo)致細菌生長下降(光吸收)。

計算RFP/OD600的比值可以用來測定蛋白表達相對于細菌群體密度。使用SoftMaxPro7版本軟件，我們計算出RFP/OD600比值(圖 5)。基于動力學(xué)追蹤，250 μMIPTG處理的細菌每個細胞所表達的RFP是最多的。

結(jié)論

我們展示了Molecular Devices SoftMaxPro7版本軟件和多功能酶標(biāo)儀配合使用能夠在一段時間內(nèi)同時檢測許多生物學(xué)事件。盡管展示的實驗較為簡單，但這一應(yīng)用也適合于更為復(fù)雜的實驗。

參考文獻

1. Malakar, P. and Venkatesh, K.V. (2012)Effect of substrate andIPTG concentrationson the burden to growth of Escherichiacoli on glycerol dueto theexpression of Lac proteins. AppliedMicrobiology and Biotechnology, 93(6),2543-2549.

2. Lee, T.S., Krupa, R.A., Zhang, F.,Hajimorad, M., Holtz, W.J.,Prasad, N.,Lee, S.K., and Keasling, J.D. (2011)BglBrick vectors and datasheets:asynthetic biology platform for geneexpression. Journal of Biological Engineering,5, 12.