細(xì)胞凋亡檢測操作流程2--BrdU檢測凋亡細(xì)胞DNA斷裂片段
凋亡檢測操作流程
二、 BrdU檢測凋亡細(xì)胞DNA斷裂片段
相關(guān)試劑及組分：
一步法: APO-DIRECT試劑盒（貨號：556381）：
| PartA（4°C保存） | PartB（-20°C保存） |
| PI/RNase A Solution | FITC-dUTP |
| Reaction Buffer | TdT Enzyme |
| Rinsing Buffer | Negative Control Cells：已固定細(xì)胞 |
| Wash Buffer | Positive Control Cells：已固定細(xì)胞 |
二步法: APO-BRDU™試劑盒（貨號：556405）：
| PartA（4°C保存） | PartB（-20°C保存） |
| FITC-Labeled Anti-BrdU mAb | Br-dUTP |
| PI/Rnase staining buffer | |
| Reaction Buffer | TdT Enzyme |
| Rinsing Buffer | Negative Control Cells：已固定細(xì)胞 |
| Wash Buffer | Positive Control Cells：已固定細(xì)胞 |
實(shí)驗(yàn)操作（適用于APO-DIRECT試劑盒）：
1. 細(xì)胞固定：
1) 用PBS洗細(xì)胞后，將細(xì)胞重懸于1%多聚甲醛的PBS溶液中，濃度為1-2x106/ml，冰浴30-60分鐘。
1. 細(xì)胞固定：
1) 用PBS洗細(xì)胞后，將細(xì)胞重懸于1%多聚甲醛的PBS溶液中，濃度為1-2x106/ml，冰浴30-60分鐘。
2) 300xg離心5分鐘，棄上清。
3) 用5ml PBS洗細(xì)胞兩次，重懸于70%乙醇中，濃度為1-2x106/ml，冰浴30-60分鐘。（70%乙醇
細(xì)胞懸液在-20°C放置12-18小時后進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，得到的效果最好。細(xì)胞可以在-20°C保存幾
個月。）
2. 配制染色液，現(xiàn)用現(xiàn)配。
| DNA標(biāo)記液 | 1個測試 | 5個測試 | 10個測試 |
| Reaction Buffer | 10.00μl | 50.00μl | 100.00μl |
| TdT Enzyme | 0.75μl | 3.75μl | 7.50μl |
| FITC-dUTP | 8.00μl | 40.00μl | 80.00μl |
| 蒸餾水 | 32.2500μl | 161.25μl | 322.50μl |
| 總體積 | 51μl | 255μl | 510.00μl |
3. 細(xì)胞染色：
1) 取離心管和Falcon試管，按標(biāo)本順序編號。
2) 取1x106細(xì)胞懸液加入離心管中，300xg離心5分鐘，棄去乙醇，留下沉積細(xì)胞。
質(zhì)控細(xì)胞（Negative Control Cells、Positive Control Cells）：混勻后取1ml（細(xì)胞數(shù)約 1x10^6/ml）加入離心管中，300xg離心5分鐘，棄去乙醇，留下沉積細(xì)胞。
3) 每管各加入1.0ml Wash Buffer，洗細(xì)胞兩遍，棄上清。
4) 加入DNA標(biāo)記液50μl重懸細(xì)胞。
5) 37°C溫育60分鐘（或者室溫過夜），每15分鐘搖勻一次。（非質(zhì)控細(xì)胞37°C溫育時間需根據(jù)不同 情況有所凋整。）
6) 每管加入1.0ml Rinse Buffer，300xg離心5分鐘，棄上清。重復(fù)兩遍，棄去上清。
7) 加入0.5ml PI/RNase A Solution，混勻。若細(xì)胞濃度低，可將用量調(diào)整到0.3ml。
8) 室溫避光孵育30分鐘。
9) 3小時內(nèi)上流式細(xì)胞儀測定結(jié)果。
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