實驗步驟

1. 蛋白質雙向電泳

1) 第一向固相pH梯度等電聚焦電泳

a. 上樣：第一向等電聚焦采用膠內加樣的方法進行。精確吸取一定量的蛋白樣品(銀染樣品的蛋白上樣量為140 ug計，考染樣品為1.3 mg)加入重泡漲液(8 mol/L尿素，2%CHAPS，痕量濱酚藍，20 mmol/L DTT，0.5 % IPG buffer)，使終體積達到350ul。混勻后均勻加在IPG膠條holder的正、負極之間。將預制IPG膠條(pH 3 -10 NL)除去保護膜，膠面向下，覆于holder中的樣品之上；慢慢下壓膠條，并前后移動，避免生成氣泡。在膠條上方均勻封以1 ml覆蓋油，蓋上蓋子。

b. 等電聚焦：將裝有樣品和IPG膠條的strip holder置一向電泳儀(IPGphorTM Isoelectric Focusing System)上進行等電聚焦。等電聚焦參數：0V電壓下泡漲3h，30V電壓下泡漲10 h，500 V電壓下電泳0.5 h，2000V電壓下電泳0.5 h，5000 V電壓下電泳0.5 h，8000 V電壓下電壓20 h。

c. 膠條的平衡：第一向電泳結束后，取出IPG膠條平衡兩次，每次15 min。平衡緩沖液(50 mol/L Tris buffer pH 8.8，6 mol/L尿素，30甘油，0.8 g澳酚藍，20 mmol/L DTT，含2 % (w/v) SDS)可減少電內滲，有利于蛋白質從第一向轉移到第二向。在第二步平衡中用100mmol/L碘乙酞胺代替DTT以除去第一步平衡時的DTT。平衡后的IPG膠條沿邊緣用濾紙吸去多余的平衡液。

2) 第二向垂直SDS-PAGE

根據IPG conversion Kit的體積，配制大小為200 mmX200 mmX 1mm，濃度為12.5%T，3.3%C的均勻膠。將平衡好的IPG膠條移至凝膠上方，用0.5%瓊脂糖電泳緩沖液封閉。電泳的緩沖液系統為Tris-Glycine-SDS系統(500 ml，SX，7.5 g Tris，2.5 g SDS，36 g Glycine)。一向膠條和二向膠接觸面避免氣泡產生；封膠溫度不能過高，封膠時不要引入氣泡。

電泳參數設置：14-15℃恒溫下，以每膠條計

20 mA恒流電泳40 min

30 mA恒流電泳至澳酚藍電泳到底部。

2. 染色

1) 銀染法：將二向電泳完成后的SDS-PAGE轉移至固定液(40%無水乙醇，10%冰醋酸)中，固定30 min；棄固定液換敏化液(30%無水乙醇，6.8%醋酸鈉，0.2%硫代硫酸鈉，0.5%戊二醛)敏化30 min；棄敏化液，以雙蒸水200 ml洗2次，每次30 min；之后置于銀染液((0.25%硝酸銀，40%甲醛)染色20 min，染色時避光；棄銀染液，以雙蒸水200ml洗2次，每次1 min；顯色液((2.5%碳酸鈉，20%甲醛)顯色2-5 min，至蛋白質點完全顯現為止；棄顯色劑，立即換終止液(1.46 %EDTA)，終止顯色10 min；以超純水洗3次，每次5 min。

2) 考馬斯亮藍染色(考染)法：將二向電泳完成后的SDS-PAGE轉移至固定液(50%無水乙醇，10%冰醋酸的水溶液)中，固定30 min以上；棄固定液，加入染色液(10%冰醋酸，G-350過濾所得)，熱染10 min；之后轉移至脫色液中(10%冰醋酸水溶液)過夜，直至背景色脫盡；超純水清洗。

3. 圖像分析

以ImageScanner光學掃描儀在256色和300 dpi分辨率下對凝膠進行掃描。以Image Master 2D Elite 3.01分析軟件完成圖像分析。

4. 肽質量指紋譜(Peptide mass fingerprinting，PMT)分析樣品制備

    1) 脫色：選取2D膠上目的蛋白斑點，用干凈解剖刀片沿染色邊緣切下蛋白點，并切成1-2 mm大小的膠片，另切一塊無蛋白的2D膠作空白對照，用水清洗幾次后用含50%乙睛，25 mmol/I，NH4CO3溶液振搖20 min，棄去溶液，重復1-2遍至膠片中的藍色褪盡。

    2) 酶切：將膠片真空離心干燥20 min，使其完全脫水體積縮小，胰蛋白酶用25 mmol/L NH4CO3溶液配成0.01ug/ul，加入10ul于各樣品管中，4℃冰箱中放置30 min，待酶液完全被吸收，37℃保溫反應(封口)12 h。

    3) 肽提取：加5 % TFA(三氟醋酸)溶液120 ul于40℃保溫1h，吸出上清液，加2.5%TFA，50%ACN(乙睛)溶液120 ul于30oC保溫1h，吸出上清液，合并上清液，冰凍干燥。

5. 差異蛋白質的肽質量指紋譜分析

凍干后用10ul0.5%TFA溶解膚混合物或脫鹽后的提取液，用Bruker公司的質譜儀REFLEX III基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(Matrix  assisted  laser  desorption/ionization  time  of  flight  massspectrometry，MALDI-TOF-MS)進行分析。取1ul點靶，另取1ul a-氰基-4-經基肉桂酸溶于0.1 % TFA/50 % ACN的飽和溶液作基質，室溫干燥。質譜儀采用激光波長337 nm，反射檢測。

6. 數據庫檢索初步鑒定蛋白質

數據庫檢索程序根據輸入的蛋白質等電點、分子量范圍及膚指紋譜數據和其它一些參數在數據庫中尋找與這些參數相匹配的蛋白質。檢索數據庫程序為：http://www.matrixscience.com