電轉(zhuǎn)化儀高效轉(zhuǎn)染mRNA進入小鼠受精卵形成穩(wěn)定突變體
隨著小鼠基因組序列測序完成，許多研究都圍繞著功能基因參與的生物學(xué)過程，特別是發(fā)育和疾病研究領(lǐng)域。那么穩(wěn)定遺傳修飾的模型動物對于闡明基因的作用十分重要，然而，傳統(tǒng)的方法，包括在胚胎干細(xì)胞中的同源重組或是構(gòu)建小鼠嵌合體，既耗時又耗力。然而新的基因組編輯方法明顯的優(yōu)化這個過程。在有效的基因組編輯方法中CRISPR/Cas 9系統(tǒng)是構(gòu)建攜帶修飾基因組最簡單的方法。
雖然，CRISPR/Cas9系統(tǒng)簡化了形成突變體的過程，但是將DNAs/RNAs微注射入受精卵需要特殊的技術(shù)，得到大量的突變體也十分耗時間（注射數(shù)以百計的受精卵）。那么，為了簡化這個過程，我們嘗試用電轉(zhuǎn)化儀將RNA導(dǎo)入受精卵。
電轉(zhuǎn)也被用于過小鼠受精卵，但是過程涉及去除卵透明帶，或是用酸臺氏液薄化處理，這些對細(xì)胞是非常有毒性的，而且只有短小的RNAs（短于1kb）可以被導(dǎo)入。
近期，一只大鼠突變體成功構(gòu)建，借助于在保持卵透明帶完好的前提下轉(zhuǎn)染Cas9mRNA和gRNA入大鼠受精卵。然而基因組編輯的效率很低（低于9%），而且需要大量的Cas9（1000-2000ng/ul）。
Figure 1. Optimal conditions for the electroporation used to deliver mRNA into fertilized eggs.(a) Electroporation set-up used in this study. The right box is the electroporator CUY21 EDIT II (BEX Co.Ltd),which generates electric pulsed, and the left is a stereoscopic microscope for embryo manipulation. Two electrodes were placed on the microscope stage and connected to the electroporator.
Figure 2. CRISPR/Cas9mediated genome editing by electroporation. (b)Examples of embryos from the three classes that exhibited different limb phenotypes: no limbs (type I), limb defects (type II, left hind limb deficiency, right: truncated fore-and hind-limb) , and normal (type III).(c)Graph summarizing the effects of Cas9 and gRNA electro-poration on limb development. The concentrations of RNAs used in each experiment are shown at left. The numbers in each column are the number of embryos exhibiting the phe-notype in each category.
Figure 3. The single-stranded oligodeoxynucleotide(ssODN)-induced generation of HDR-mediated instertions.(b) Representative embryo electroporated with Cas9 mRNA, gRNA, and ssODN.The mCherry florescene completely disappeared in the electroporated embryos, while control (no electroporation) embryos displayed florescent signals.
接下來，我們揭示了這種突變是否會在下一代中遺傳下來。電轉(zhuǎn)200ng/ul Cas9 mRNA和100ng/ul的gRNA入卵細(xì)胞，靶向mCherry基因。觀察25只F0代小鼠，均無紅色熒光表達。而且所有的F1代小鼠同樣沒有紅色熒光，而且mCherry基因被打斷。說明基因編輯突變體可以穩(wěn)定遺傳。
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