2. 將標(biāo)本放在卡片的一端。標(biāo)記該卡片，將帶有標(biāo)本的一端浸入液氮中。60s后，取出標(biāo)本并放在干冰上。修剪卡片，使其大小剛好比組織塊稍大些，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的(-70℃)帶有標(biāo)記的小瓶中。

3. 切片前，用1％明膠包被潔凈的載玻片。加熱至50℃使明膠溶于水中，冷卻，加入0.02％疊氮鈉。將玻片浸入明膠溶液中30s，取出，自然干燥。

4. 按照儀器使用說(shuō)明書(shū)，用低溫恒溫器制備冷凍切片。通常切片厚度在5-10gm之間。用包被過(guò)的載玻片收集切片。

5. 讓切片自然干燥。浸入新鮮配制的4％多聚甲醛中2min。

6. 用PBS洗數(shù)次，放入含1％NP-40的PBS中5rain。用PBS洗數(shù)次。

7. 將帶有組織切片的載玻片放在濕盒中。加合適稀釋度的一抗，用含蛋白質(zhì)的溶液如3％BSA／PBS稀釋抗體。

單克隆抗體最好選用雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清(特異性抗體濃度為20-50gg／m1)。小鼠腹水、純化的單克隆抗體和多克隆抗體，以及粗制的多克隆抗血清應(yīng)該測(cè)試其稀釋度，以使特異性抗體的濃度在0.1～10ug／m1之間。如果特異性抗體的濃度是未知的，則制備并測(cè)試初始制品的不同稀釋度(1：10，1：100，1：1000和1：10 000)。

8. 將玻片置濕盒中于室溫下孵育至少60min。對(duì)于某些反應(yīng)來(lái)說(shuō)，孵育時(shí)間可延長(zhǎng)至24h，以增加其敏感性。

9. 用PBS洗3次，每次5min以上。

10. 加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(特異性針對(duì)一抗)。這些試劑可以購(gòu)自不同的經(jīng)銷(xiāo)商。如果二抗的確切用量是未知的，測(cè)試1：50—1：1000稀釋的二抗。用含蛋白質(zhì)的PBS稀釋?zhuān)��?％BSA／PBS。

11. 將樣本置濕盒中，于室溫下孵育30min。

12. 用PBS洗3次，每次5min以上。

13. 配制DAB／金屬鹽試劑。將6mg DAB溶于9ml 0.05mol／L Tris緩沖液(pH7.6)中。加lm[0.3％(W／V)氯化鎳貯存液(可用相同濃度的氯化鈷代替)。加0.1ml 3％過(guò)氧化氫。如果出現(xiàn)沉淀，用Whatman 1＃濾紙(或相似品)過(guò)濾。

14. 將上述溶液加到標(biāo)本中。在低倍光學(xué)顯微鏡下觀察。當(dāng)形成足夠的棕／黑色沉淀時(shí)，用水沖洗以終止反應(yīng)。通常這一反應(yīng)過(guò)程約需1-20min。

15. 加數(shù)滴Harris蘇木精。孵育約5min。時(shí)間長(zhǎng)短取決于染色的強(qiáng)度。

16. 用水輕柔沖洗。

17. 通過(guò)各級(jí)乙醇使標(biāo)本依次脫水。在75％乙醇中孵育兩次，每次3min，95％乙醇中2次，每次3min，100％乙醇中2次，每次3min。自然干燥。