實驗材料煙草細胞：BY-2

實驗步驟

1. BY-2 細胞培養

BY -2 細胞懸浮培養在搖床上，避光，溫度260 C，轉速130r pm，每7天將 1m l 細胞轉入20m l新鮮的液體培養基中繼續培養。BY -2 愈傷組織生長在固體培養基上，每3-4周繼代一次。轉基因的懸浮細胞和愈傷組織生長在含相應抗生素的培養基中。

2. 用干轉化的農桿菌GV3101的準備

(1)接種農桿菌單菌落到2 ml新鮮的YEB液體培養基中，28“培養過夜;

(2)取200ul培養物加到l0ml新的培養基中繼續培養3-4小時:

(3) '5000 rpm,離心5 min集菌，用BY-2液體培養基重懸菌體，OD為0.5左右，待用。

3. 農桿藺介導的BY-2懸浮細胞的外源基因轉化

(1)取生長到第3或4天的BY-2細胞4 ml，加入上述備用的農桿菌液100ul，共培養 3天;

(2) 500 g離心2 min，收獲細胞并用BY-2液體培養基(Amp 500 mg/L)洗3次 :

(3)將細胞稀釋后鋪于BY-2固體培養基的平板(Kan 100 mg/L, Amp 500mg /L )上，26℃黑暗培養。

(4)四周后，取出生長良好的愈傷小塊，打散后放入液體培養基懸浮培養。

4. 農桿菌介導的BY-2愈傷組織的外源基因轉化

(1)取培養2-3周的煙草愈傷組織小塊浸入農桿菌液中20 min，取出用無菌濾紙吸干，置BY-2 培養基平板(無抗生素)上培養2天;

(2)取出愈傷小塊，用無菌水洗4次，然后用含抗生素(Amp 500 mg/L)的無菌水浸泡30-60m in;

(3)取出愈傷小塊，用無菌濾紙吸干，置于培養BY-2的平板(Amp500mg/L，Kan100mg/)上。

(4)培養四周后，挑出生長的愈傷小塊，轉移到新的抗性平板(Kan 100 mg/L)

上繼續生長;

(5)取出生長良好的愈傷小塊，打散后放入液體培養基中，26'C, 130 rpm,在搖床上黑暗培養;

(6)每7天繼代一次。