流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展

流式細(xì)胞術(shù)最初是開(kāi)發(fā)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的，但是隨后逐漸演變成了細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類以及生物標(biāo)記探測(cè)等不同領(lǐng)域內(nèi)的有利工具[7]。盡管相關(guān)的第一篇采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行植物細(xì)胞核分析的文章發(fā)表于1973年[8]，但是采用流式細(xì)胞術(shù)所開(kāi)展的植物DNA分析在上世紀(jì)80年代末才獲得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，從此所有研究人員都開(kāi)始堅(jiān)定地在植物研究領(lǐng)域使用該項(xiàng)技術(shù)。基本上，植物學(xué)家都是使用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)測(cè)定植物細(xì)胞核中的DNA含量。有關(guān)流式細(xì)胞術(shù)詳細(xì)的原理及應(yīng)用的描述，請(qǐng)參閱參考文獻(xiàn)9。

圖2a概括表示了流式細(xì)胞儀如何通過(guò)電子檢測(cè)設(shè)備用一束水動(dòng)力集中的液體流對(duì)經(jīng)染色的或靶向的粒子（尺寸介于0.2µm-150µm[7]）進(jìn)行懸浮排列。在植物研究中，先用熒光標(biāo)記物（比如：DAPI[4’,6-二脒基-2-苯基吲哚]或碘化丙啶）對(duì)細(xì)胞核（比如：粒子）進(jìn)行染色。然后，每一個(gè)懸浮的細(xì)胞核暴露于光束（通常為激光或UV燈光）之中，于是光的路徑被分散并由檢測(cè)器感知，用于分析每一個(gè)單獨(dú)粒子的熒光強(qiáng)度，為核酸中DNA含量的測(cè)定提供信息。成千上萬(wàn)個(gè)完整細(xì)胞核的合并數(shù)據(jù)可為單獨(dú)組織的DNA含量提供信息（參見(jiàn)圖1中的波峰）。由于每一秒鐘幾乎會(huì)同時(shí)進(jìn)行分析多達(dá)數(shù)千個(gè)粒子的物理和/或化學(xué)特征，因此用于樣品分離和樣品檢測(cè)的溶液的質(zhì)量和純度非常關(guān)鍵。

如果使用的是低品質(zhì)或不合適的水供應(yīng)系統(tǒng)，則出現(xiàn)的不屬于樣品的污染物顆粒會(huì)發(fā)生熒光反應(yīng)并產(chǎn)生“噪聲”，這會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果并導(dǎo)致最終錯(cuò)誤的評(píng)估。因此，實(shí)驗(yàn)時(shí)必須要使用高品質(zhì)的超純水。

除此之外，arium® pro VF超純水系統(tǒng)有一個(gè)內(nèi)置的作為切向流過(guò)濾器使用的超濾模塊。該過(guò)濾器中整合的超濾膜可截留膠體、微生物、內(nèi)毒素、RNA以及DNA等。出水端口安裝有一個(gè)0.2µm的終端過(guò)濾器，用以去除超純水生產(chǎn)后分配過(guò)程中的微粒和細(xì)菌。該設(shè)備生產(chǎn)純水的工藝流程請(qǐng)參閱圖4。

材料與方法

種子樣品來(lái)源于六倍體毛茛屬植物，在自由授粉的條件下進(jìn)行挑選收集。種子個(gè)體在塑料有蓋培養(yǎng)皿內(nèi)用300µl的提取緩沖液（CyStain UV Precise P, Partec GmbH）進(jìn)行碾碎，然后在室溫下孵育10分鐘，再將細(xì)胞核過(guò)濾（30µl漿狀物，CellTric®, Partec GmbH）至一個(gè)5-mL的塑料管中。而后，加入1.2mL染色緩沖液（CyStain UV Precise P），60秒后，樣品進(jìn)入流式細(xì)胞儀（CyFlow Space，Partec GmbH；參見(jiàn)圖2b）的藍(lán)色熒光通道進(jìn)行分析。更多內(nèi)容 »

結(jié)果

總共有61個(gè)單獨(dú)種子重建了繁殖途徑。根據(jù)建議的標(biāo)準(zhǔn)程序，30個(gè)種子使用鞘液懸浮，31個(gè)種子使用ArUPH2O（電導(dǎo)率： 0.055µs/cm或18.2MΩ×cm電阻補(bǔ)償至25℃）懸浮。平均每個(gè)樣品測(cè)試了2329個(gè)細(xì)胞核，占總計(jì)數(shù)粒子的73%，而其它27%表現(xiàn)為細(xì)胞周期G2階段的細(xì)胞核或者背景信號(hào)。針對(duì)所有被分析的種子，全部要根據(jù)每個(gè)峰所富集的平均總數(shù)來(lái)計(jì)算胚胎和胚乳的平均峰位置。更多內(nèi)容 »

討論

總之，所獲得的測(cè)試結(jié)果中具有極小的差異，這證實(shí)了arium系統(tǒng)是適用于植物材料相對(duì)倍性分析的快速又經(jīng)濟(jì)的極佳選擇。高品質(zhì)的arium超純水水被證明用于實(shí)現(xiàn)流失細(xì)胞種子篩選技術(shù)上的可重現(xiàn)結(jié)果是非常有效的。盡管如此，由于抗生素和去污劑之類的添加劑具有可阻止生物膜的形成，以及增加容器、管道、閥門以及流動(dòng)腔內(nèi)表面的濕度等作用，對(duì)流失細(xì)胞系統(tǒng)的可靠操作會(huì)造成長(zhǎng)期或短期的正面影響，因此供應(yīng)商一般會(huì)建議在自制的鞘液中添加此類物質(zhì)。

簡(jiǎn)而言之，ArUPH2O可即時(shí)用于植物細(xì)胞的流式細(xì)胞技術(shù)。由于流失細(xì)胞技術(shù)在其它應(yīng)用中越來(lái)越重要，比如腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)，細(xì)胞的定量測(cè)定與形態(tài)分化，細(xì)胞周期分析，DNA-RNA含量估算，以及凋亡檢測(cè)等等，ArUPH2O的全面適用性為arium超純水在一系列使用流式細(xì)胞術(shù)的新興技術(shù)中的應(yīng)用創(chuàng)造了新機(jī)會(huì)。

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參考文獻(xiàn)

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