[摘要] 目的：研究大鼠長(zhǎng)期高脂飲食對(duì)其掠食行為的影響及機(jī)制。方法：將10只4周齡雌性SD大鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組和高脂組。對(duì)照組常規(guī)飼料飼養(yǎng)，高脂組以高脂飼料飼養(yǎng)，15周之后進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、掠食行為觀察，行為學(xué)觀察結(jié)束后立即處死動(dòng)物，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)c-Fos蛋白在大鼠前扣帶皮質(zhì)的表達(dá)情況。結(jié)果：高脂組大鼠在非競(jìng)爭(zhēng)性掠食行為與競(jìng)爭(zhēng)性掠食行為中掠食量均低于對(duì)照組(P<0.001)；高脂組前扣帶皮質(zhì)區(qū)c-Fos蛋白表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.001)。結(jié)論：長(zhǎng)期高脂飲食可降低大鼠的掠食量，且前扣帶皮質(zhì)區(qū)c-Fos蛋白表達(dá)減少、神經(jīng)元功能下降。

[關(guān)鍵詞] 高脂飲食；掠食行為；礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)；前扣帶皮質(zhì)；c-Fos；大鼠隨著生活節(jié)奏的加快，人們的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，大量的高脂食物的攝入，既可帶來(lái)一系列健康問題，比如肥胖癥、心血管疾病、代謝綜合征、糖尿病等；又可導(dǎo)致人們神經(jīng)精神方面的異常，如可損傷小鼠的記憶功能，引起小鼠活動(dòng)性增加和焦慮抑郁行為；還可引起小鼠認(rèn)知障礙。而關(guān)于高脂飲食對(duì)掠食行為的研究較少，大鼠的掠食行為涉及其對(duì)食物的搬運(yùn)、囤積以及同其他大鼠的爭(zhēng)搶，是在滿足當(dāng)下需求的同時(shí)，搜尋更多的食物滿足將來(lái)的使用，是一種適應(yīng)與生存的戰(zhàn)略。因此本實(shí)驗(yàn)將觀察長(zhǎng)期高脂飲食對(duì)大鼠掠食行為的影響，同時(shí)觀察大鼠大腦前扣帶皮質(zhì)c-Fos蛋白表達(dá)變化，探究高脂飲食對(duì)大鼠掠食行為的影響與機(jī)制。

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)雌Sprague-Dawley (SD)大鼠10只，4 周齡，由中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的體質(zhì)量為70~90 g。全身健康要求：毛發(fā)色澤光亮，無(wú)脫毛，四肢和尾部無(wú)疾病，頸部無(wú)歪斜。所有大鼠于實(shí)驗(yàn)開始前1周飼養(yǎng)于同一動(dòng)物房以適應(yīng)環(huán)境，均能自由飲水和進(jìn)食，食物為標(biāo)準(zhǔn)顆粒狀飼料。動(dòng)物房溫度控制于20~22 ℃，通風(fēng)良

好，保持自然明-暗生物節(jié)律。

1.1.2 飼料和主要設(shè)備與化學(xué)試劑

大鼠標(biāo)準(zhǔn)的顆粒狀飼料由中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供；高脂飼料為自制(配方取自章濤等：普通飼料50%，豬油12%，奶粉10%，豆粉5%，花生2.5%，蔗糖5%，菜油1%，食鹽1%)；曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱和配套Supermaze軟件為上海欣軟信息科技有限公司產(chǎn)品；Leica冰凍切片機(jī)為武漢中紀(jì)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；尼康顯微鏡為尼康儀器有限公司產(chǎn)品；多聚甲醛為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；磷酸二氧鈉為國(guó)際集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；磷酸氫二鈉為長(zhǎng)沙安泰精細(xì)化工實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；蔗糖為廣東光華科技股份有限公司產(chǎn)品；0.01 mol/L磷酸能緩沖溶液和DAB顯色劑為北京中山金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；c-Fos一抗為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品，山羊血清、二抗以及三抗為美國(guó)Vector Labs產(chǎn)品；無(wú)水乙醇和二甲苯為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 高脂飲食模型建立

將10只雌性大鼠隨機(jī)分成兩組，每組5只。對(duì)照組用普通飼料喂養(yǎng)15周，高脂組用自制高脂飼料喂養(yǎng)15周。所有大鼠在造模期間自由攝食和飲水，飼料和水每2日更換1次。

1.2.2 行為學(xué)檢測(cè)
1.2.2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱(長(zhǎng)×寬×高：100 cm×100 cm×50 cm)，箱底標(biāo)記成25個(gè)相等方格(20 cm×20 cm)，沿四壁的16個(gè)方格稱為外圍格，其余9個(gè)方格為中央格。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠放于正中央格，攝像并記錄5 min大鼠穿行中央格格數(shù)、穿行的總格數(shù)以及中央格停留時(shí)間。在中央格停留時(shí)間占總時(shí)間(5 min)百分比與大鼠的焦慮樣情緒呈負(fù)相關(guān)。穿越總格數(shù)反映動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能。

1.2.2.2 非競(jìng)爭(zhēng)性掠食行為觀察

掠食模型參照Li等的方法：動(dòng)物掠食行為的觀察在一單獨(dú)、安靜、隔音的房間內(nèi)進(jìn)行，房間內(nèi)放有曠場(chǎng)(長(zhǎng)×寬×高：150 cm×150 cm×50 cm)，曠場(chǎng)底及四壁為黑色，待測(cè)大鼠進(jìn)行掠食行為觀察前，需節(jié)食1周，每天給予少量食物，足量飲水，使體質(zhì)量降到之前的80%左右；然后在觀察前1 d禁食(不禁水)12 h，觀察當(dāng)日下午4:00將大鼠放入曠場(chǎng)中，適應(yīng)2 h后，于曠場(chǎng)一側(cè)放入一塑料制鼠籠(長(zhǎng)×寬×高：30 cm×18 cm×16 cm)，將250 g標(biāo)準(zhǔn)的大鼠顆粒狀飼料放于鼠籠的鐵絲網(wǎng)頂蓋上，2 h后，分別收集鼠籠頂蓋上剩余飼料以及散落在曠場(chǎng)中的飼料，并分別稱重。散落在曠場(chǎng)中的飼料量即為大鼠掠食量。

1.2.2.3 競(jìng)爭(zhēng)性掠食行為觀察

觀察設(shè)備同非競(jìng)爭(zhēng)掠食行為觀察，觀察前禁食(不禁水)12 h，觀察當(dāng)日下午4:00將大鼠放入曠場(chǎng)中，適應(yīng)2 h后，于曠場(chǎng)一側(cè)放入一塑料制鼠籠(長(zhǎng)×寬×高：30 cm×18 cm × 16 cm)，鼠籠中放置一只同待測(cè)大鼠性別相同，來(lái)源于不同窩，之前從未接觸的大鼠。將250 g標(biāo)準(zhǔn)的大鼠顆粒狀飼料放于鼠籠的鐵絲網(wǎng)頂蓋上，2 h后，分別收集

散落在曠場(chǎng)中的飼料以及鼠籠頂蓋上剩余飼料，并分別稱重。散落在曠場(chǎng)中的飼料量即為大鼠掠食量。

1.2.3 大鼠前扣帶皮質(zhì) c-Fos 蛋白免疫組織化學(xué)檢測(cè)在大鼠非競(jìng)爭(zhēng)性掠食進(jìn)行1 h 45 min時(shí)，迅速取出大鼠，用10%水合氧醛(40 mg/kg)于大鼠腹腔注射麻醉后迅速取腦，將腦組織置入固定液中后固定過夜，再分別置于15%，30%蔗糖PBS液中浸糖至沉底，用最佳切割溫度(optimal cuttingtemperature，OCT)復(fù)合物包埋，置于恒溫冰凍切片機(jī)連續(xù)切片，片厚30 m，取含前扣帶皮質(zhì)的切片。采用免疫組織化學(xué)ABC法對(duì)切片行c-Fos免疫組織化學(xué)染色、Olympus顯微鏡觀察。對(duì)照組與高脂組各選取3張切片，拍照并計(jì)數(shù)10×10倍鏡視野下陽(yáng)性細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用GraphPadPrism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，以P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1 行為學(xué)檢測(cè)

2.1.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

曠 場(chǎng) 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 如 圖 1 所 示 ： 中 央 格 停 留時(shí)間百分比，高脂組(10.43%±2.87%)與對(duì)照組(12.23%±2.79%)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( t = 0 . 4 5 0 ， P = 0 . 6 6 4 7 ) ；穿行總格數(shù)，高脂組( 1 2 7 . 1 0 % ± 3 7 . 8 9 % ) 與對(duì)照組 ( 9 8 . 9 0 % ± 1 7 . 1 5 % ) 相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.676，P=0.5172)。

2.1.2 掠食行為

掠食行為結(jié)果如圖2所示：對(duì)照組大鼠在非競(jìng)爭(zhēng)性掠食行為、競(jìng)爭(zhēng)性掠食行為觀察中，每2 h掠食量分別為(84.80±2.77) g，(89.94±1.96) g。高脂組在非競(jìng)爭(zhēng)性掠食行為、競(jìng)爭(zhēng)性掠食行為觀察中，每2 h掠食量分別為(13.85±1.08) g，(12.25±1.07) g；與相應(yīng)對(duì)照組相比掠食量減少(非競(jìng)爭(zhēng)性掠食行為t=21.65，P<0.001；競(jìng)爭(zhēng)性掠食行為t=32.17，P<0.001)。

2.2 大鼠前扣帶皮質(zhì) c-Fos 蛋白免疫組織化學(xué)檢測(cè)如 圖 3 所 示 ： 對(duì) 照 組 陽(yáng) 性 細(xì) 胞 數(shù) 為( 8 8 . 1 7 ± 4 . 1 4 ) 個(gè) / 視野，高脂組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為(45.00±2.56)個(gè)/視野，對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目高于高脂組(t=8.868，P<0.001)。

掠食行為是一種高度綜合的模型，可用于探討心理學(xué)、生理學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)等多學(xué)科的不同問題；同時(shí)，掠食行為也是行為科學(xué)理論研究的重要模型，掠食行為與決策、努力付出、成本/效益估計(jì)等認(rèn)知功能密切相關(guān)。利用掠食行為闡明長(zhǎng)期高脂飲食對(duì)認(rèn)知功能的影響，探究長(zhǎng)期高脂飲食對(duì)大鼠掠食行為的影響及機(jī)制，對(duì)人們的健康具有指導(dǎo)意義。

許多研究者利用嚙齒類動(dòng)物掠食行為探討認(rèn)知功能的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制之前，往往要對(duì)動(dòng)物進(jìn)行人為訓(xùn)練，過多的訓(xùn)練影響大鼠的行為自主性，從而影響到掠食行為結(jié)果，不能反映其真實(shí)的神經(jīng)生物學(xué)本質(zhì)。因此，筆者采用了Li等的實(shí)驗(yàn)室大鼠掠食行為觀察模型排除了人為因素對(duì)大鼠掠食行為的影響，并且定量測(cè)定大鼠的掠食行為，探討其神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能和狀態(tài)焦慮的經(jīng)典方法。我們以此來(lái)判定不是由運(yùn)動(dòng)能力、探究行為、動(dòng)物情緒等改變?cè)斐蓜?dòng)物掠食行為障礙。對(duì)照組與高脂組礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示高脂飲食對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)功能無(wú)影響。

本研究發(fā)現(xiàn)高脂組大鼠在非競(jìng)爭(zhēng)性掠食行為、競(jìng)爭(zhēng)性掠食行為中掠食量較對(duì)照組明顯減少，這提示高脂組大鼠不愿付出努力去獲取更多的食物，表明高脂飲食確實(shí)會(huì)影響大鼠掠食行為。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)多個(gè)腦區(qū)以及多種化學(xué)物質(zhì)參與調(diào)控嚙齒類動(dòng)物的掠食行為。前扣帶皮質(zhì)位于前額葉的內(nèi)側(cè)部分，參與調(diào)控認(rèn)知、學(xué)習(xí)、社會(huì)評(píng)估等復(fù)雜行為。前扣帶皮質(zhì)受到毀損的靈長(zhǎng)類個(gè)體在強(qiáng)化介導(dǎo)的選擇任務(wù)中不能正確地整合風(fēng)險(xiǎn)和回報(bào)。嚙齒類動(dòng)物前扣帶皮質(zhì)受損研究表明：前扣帶皮質(zhì)受損的大鼠放棄“付出越多得到越多”的行為，更愿意少花力氣獲得少的收入。李明波等研究表明：雙側(cè)前扣帶皮質(zhì)損毀后的大鼠掠食行為明顯受損，其中競(jìng)爭(zhēng)性掠食量下降最為明顯。本研究結(jié)果顯示高脂組大鼠的掠食量明顯減少，推測(cè)高脂飲食大鼠掠食行為障礙可能與前扣帶皮質(zhì)功能改變有關(guān)。c-Fos蛋白作為參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的第三信使，其表達(dá)可反映神經(jīng)元對(duì)某種刺激的活動(dòng)情況，常被作為神經(jīng)元激活的標(biāo)志。本研究中高飲食大鼠在掠食過程中前扣帶皮質(zhì)內(nèi)c-Fos表達(dá)明顯減少，提示長(zhǎng)期高脂飲食影響大鼠掠食行為的機(jī)制可能與前扣帶皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元功能下降有關(guān)；具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步的探討。