強強聯合：在CRISPR/Cas9相關研究中應用高通量測序技術
強強聯合：在CRISPR/Cas9相關研究中應用新一代測序技術
摘要：
CRISPR/Cas9基因組編輯技術和新一代測序技術（也稱高通量測序技術），是當今對生命科學研究有重大影響的兩項技術。二者并非毫不相干。有效地將二者聯用，有時可以大大加速科研進程。兩者之間有什么樣的聯系呢？在哪些研究領域或方向上可以聯用呢？上海伯豪生物根據在這兩個領域的技術服務經驗，對相關內容進行了系統地整理。
一．引言
在分子生物學的發展歷史中，人們曾經不止一次地從微生物的某些生命活動中得到啟示，發展出了對于DNA操作有重要意義的工具，如分子克隆用的限制性內切酶和PCR用的耐熱聚合酶。它們為分子生物學的發展帶來了革命性的影響。近兩三年來，另一種從細菌的獲得性免疫系統發展而來的革命性的基因操作工具CRISPR/Cas9受到廣泛關注，其應用和影響范圍仍在不斷擴大。CRISPR/Cas9系統的發現與DNA測序技術分不開，它的發展與推廣仍然得益于DNA測序技術。CRISPR/Cas9技術與近五、六年來同樣快速發展的DNA新一代測序技術（Next Generation Sequencing, NGS, 也稱高通量測序技術）相結合，不但可以使研究者高效快速地得到一些實驗結果，也拓寬了這一技術的應用范圍。
二．CRISPR/Cas9系統簡介
CRISPR/Cas9技術的產生與DNA測序技術的進步密不可分。1987年在對大腸桿菌E.coli K12的一個區段的測序結果的分析中，研究者首次發現細菌了堿性磷酸酶基因附近存在著成簇的規律間隔的短回文重復序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat, CRISPR）。在接下來的十多年間，隨著DNA測序技術的飛速發展，微生物基因組測序數據顯著增多，更多的CRISPR在細菌和古細菌中被發現。據估計40%的細菌和90%的古細菌基因組具有CRISPR結構。CRISPR 由一系列短的高度保守的正向重復序列(repeats) 與長度相似的間隔序列（spacers）間隔排列組成（見圖1）。本世紀初，CRISPR位點附近的、高度保守的Cas基因（CRISPR-associated genes）引起了研究者關注。Cas基因是一類基因家族，編碼的蛋白具有與核酸結合功和核酸酶、聚合酶、解旋酶等活性。2005年，得益于病毒、質粒測序數據的日益豐富，通過對測序數據的系統分析，研究者推測間隔序列可能與外來的病毒、質粒有關。通過一系列的研究，人們認識到Cas基因可以與CRISPR序列協同作用，使細菌對病毒具有獲得性免疫功能，而間隔序列則編碼引導Cas蛋白定位的向導RNA的部分區段。
圖1. 基因組CRISPR位點。摘自Doudna JA, Charpentier E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014 Nov 28;346 (6213) :1258096.
根據Cas基因的不同，人們將CRISPR/Cas系統分為I-III三類。其中II類CRISPR/Cas系統包含一個Cas9蛋白。這類系統最先在改造后用于小鼠和人類基因組編輯，同時也是目前研究最為充分的系統。它只需要單獨的Cas9蛋白即可在gRNA（guide RNA）的引導下完成對DNA的定點切割。Cas9蛋白可以通過突變改造為具有不同功能的衍生蛋白，例如只具有DNA結合功能而無切割功能的dCas9和只具有單鏈切割功能的Cas9n（也稱nCas9） 等。Cas9蛋白行使功能需CRISPR轉錄而來的crRNA與反式激活的、與CRISPR 重復區互補的tracrRNA （trans-activating crRNA，tracrRNA） 形成的復合物參與。為了操作簡便，研究者將crRNA和tracrRNA 融合進同一條單鏈中，設計出單鏈引導RNA（single guide RNA，sgRNA）。對靶序列有效的切割還需靶序列相鄰的原型間隔序列毗鄰基序，即PAM （protospacer-associated motif）。圖2顯示了CRISPR/Cas9 系統的主要元件。為了增強系統的特異性或實現某些特定的功能，除了前面提到的對Cas9蛋白的改造外，一些實驗室還對有的元件進行了其它方面的改進。
圖2. RNA 引導Cas9與目標DNA結合并將其切割。摘自Doudna JA, Charpentier E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014 Nov 28;346(6213) :1258096.
三．CRISPR/Cas9技術的應用領域
對生物體包括人類自身的基因組進行高效自由地操作是許多生命科學和醫學工作者的夢想。與傳統的基因打靶、ZFN和TALEN等基因組操作技術相比，CRISPR/Cas9技術簡單、高效，也不失精準。它已經成為基因組工程的有力工具。它在生命科學基礎研究、生物技術和醫藥領域有廣泛的應用前景。短短一兩年，該技術成功應用于動植物及微生物的報道已屢見不鮮。在生物學基礎研究領域，它有助于快速解析基因功能及基因間的相互作用；在生物技術領域，它有助于定向育種，有助于抗逆、高產或有特殊經濟性狀的作物或菌種的培育；在醫藥領域，利用它可以快速建立疾病模型，可以進行基因治療和新藥開發。CRISPR/Cas9的推廣和應用步伐可謂一日千里。
四．CRISPR/Cas9技術與新一代測序技術的聯用
革命性技術總是發展迅速、應用廣泛的。作為另一項革命性的生命科學研究技術，DNA新一代測序技術在近五、六年得到快速發展和推廣。它已經用于生命科學相關領域的許多方面。同樣地，也可以用在CRISPR/Cas9相關的研究中。兩者之間的應用領域有許多交叉或重合。
1．高通量測序可用于檢驗CRISPR/Cas9基因組編輯的結果，以及進行脫靶效應的分析
編碼Cas9和sgRNA的片段通過質粒或其它途徑轉染進細胞后，Cas9在特異的位點對目標基因組進行切割，引起DNA雙鏈斷裂 （double-strand break, DSB），通過非同源末端連接（nonhomologous end joining, NHEJ）或同源重組（homologous recombination, HR），產生DNA的插入或刪除（indel），或者依賴于含有特異突變的同源模板，進行目的位點的定向改造。基因組編輯的結果需要確認。對于目標位點或計算機預測的脫靶位點，除了用核酸酶進行電泳分析檢測外，還可以用DNA測序方法確認是否有變。當需要檢測的樣品較少或靶位點較少時，可以采用Sanger測序。當樣品或靶位點較多時，適合采用高通量測序。這需要用測序引物對靶位點進行PCR擴增，然后對擴增子（amplicon）測序。幾種當前常用的高通量測序平臺均被不同的實驗室采用過。因為不同的高通量測序平臺測序的最大讀長不一樣，需要注意擴增產物的長度和測序引物的位置。曾有報道，讀長較長的SMRT DNA 測序對于基因組編輯的結果評估也很有意義。
CRISPR/Cas9的特異性是人們對該系統關心的一個問題。 它被關注后不久有報道提出了CRISPR/Cas9的脫靶問題。脫靶效應與諸多因素有關，如sgRNA自身的特征、濃度及其與Cas9的相對量多少等等。人們通過改造這個系統的元件或采用不同的策略增加基因組編輯的特異性。盡管一些文獻報道，對人類iPSC進行CRISPR/Cas9編輯具有很高的特異性，人多能干細胞中的脫靶突變發生率很低，但基因組編輯的安全性仍然是人們擔心的一個問題，尤其在基因治療領域。全基因組測序（whole genome sequencing ）可以對整個基因組進行單堿基分辨率的檢測，當CRISPR/Cas9用于基因治療等對安全性要求較高的領域時，有必要采用這一方法檢測基因組編輯的效果。當前已有不少對CRISPR/Cas9編輯后的基因組進行全測序的實例。
對于基因組比較大的生物體來說，全基因組測序花費畢竟是高昂的。那么，此時如何了解CRISPR/Cas9 在某種生物或某類型的細胞上是否容易脫靶呢？對于目標區域進行富集，然后對富集的片段進行高通量測序，是一種策略。對于DSB區域的富集與檢測，曾報道過BLESS 法（Breaks Labeling, Enrichment on Streptavidin, and next generation Sequencing ）。最近，J. Keith Joung 領導的小組報道了一種檢測方法，稱為Guide-seq （Genome-wide, Unbiased Identification of DSBs Enabled by sequencing）。這種方法的過程是，使活體細胞吸收雙鏈寡核苷酸（double-stranded oligodeoxynucleotides，dsODN）標簽并整合進基因組斷裂位點，抽提基因組DNA，進行隨機打斷和末端修復加高通量測序接頭等操作，然后依據dsODN的專有序列進行PCR擴增，富集出包含dsODN的片段，對收獲的片段進行高通量測序，分析Cas9的切割位點（過程示意見圖3）。它適合臨床前對所采用的CRISPR/Cas9在某類細胞中的應用風險進行評估。
圖3. Guide-seq 的流程。摘自Tsai SQ等， GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 2014 Dec 16.
在進行CRISPR/Cas9脫靶效應分析時，有些研究者采用了染色質免疫共沉淀結合高通量測序的方法（chromatin immunoprecipitation and high throughput genome sequencing, ChIP-seq)，通過特異性的抗體捕獲Cas9或其衍生物結合的DNA片段。這也是一種富集測序策略。
2． CRISPR/Cas9技術與高通量測序結合用于研究基因的功能
Cas9包含兩個活性區域，即RuvC 和 HNH 結構域，各負責切割一條DNA單鏈。當只有一個結構域引入突變時，Cas9可被改造成為切口酶（nickase）nCas9。nCas9與兩條不同的sgRNA聯用可用于較大片段的置換，也可增強編輯的特異性；當兩個結構域同時引入突變時，Cas9內切活性喪失，成為dCas9（dead Cas9）， dCas9仍能與靶區域結合。dCas9 可以用來開啟或關閉某些基因的表達。它與目的基因啟動子區域或編碼區段時，可能由于空間位阻效應阻擋了轉錄因子或 RNA 聚合酶與 DNA 的結合，從而抑制轉錄。將dCas9與轉錄調控因子如KRAB的抑制區融合，可抑制靶基因，這就是CRISPRi（CRISPR interference）；dCas9也可與VP64的激活區結合，激活靶基因。dCas9的這種特異性調控功能，與 RNA-seq相結合，可以用于許多基因功能相關的研究。CRISPRi用于真核生物時甚至比RNAi還具有優勢。
不通過RNA-seq這種方法，CRISPR/Cas9技術與高通量DNA測序結合也可進行功能基因組學研究。國內外一些研究者已經通過CRISPR/Cas9技術建立可能與某類功能相關的突變體庫，通過功能性篩選和富集、PCR擴增以及深度測序分析，確認與這類功能相關的基因。
3． 新一代測序的結果，為CRISPR/Cas9技術的應用提供了對象
新一代測序技術既可以在全基因組或全轉錄組范圍內篩選出基因或其轉錄產物的變化，也可以在某個局部范圍（如外顯子組內）考察基因的變異。這項技術適合在其它線索很少的情況下（如基因位置信息）篩選出與某些功能相關的、變異的目標基因。這些目標基因的具體功能可以用CRISPR/Cas9技術進行研究。
例如，CRISPR/Cas9技術與高通量測序技術相結合，在藥物開發中可用于快速發現藥物的靶標并進行有效、直觀的驗證。這對探究藥物的藥理、毒理或細胞的抗藥機理非常有意義。它是一種可用于反向遺傳學的技術，可以從另一角度驗證正向遺傳學的結果。先用藥物處理細胞，選出藥物抗性克隆，對這些克隆進行新一代測序，找出候選的基因突變，這些基因的產物可能是藥物的靶標。如何確認某一（或某些）候選基因突變導致藥物抗性？研究者們采用CRISPR/Cas9技術突變這一（或這些）基因，觀察細胞是否出現抗性。在這類研究中，用新一代測序大范圍內快速發現候選的基因突變，非常有必要。有些研究者通過對基因組測序發現侯選的突變；有人則為了兼顧研究基因表達情況，采用了轉錄組測序的方法進行突變檢測。
再如，對于腫瘤組織與癌旁組織進行轉錄組測序，選出某些差異基因，再用CRISPR/Cas9 系統驗證這些基因的功能，也是對腫瘤相關基因進行研究的一條策略。
總之，新一代測序可以為許多進一步的研究（包括利用CRISPR/Cas9技術的研究）找到切入點。
4． 新一代測序可以用于研究自然界存在的更多物種的CRISPR/Cas 系統
CRISPR/Cas 是一類基于基因的功能系統，它自身也可以用新一代測序技術加以研究。前文已提到，自然存在的CRISPR/Cas 系統有多種類型，CRISPR/Cas9只是其中的一類。深入研究和了解不同類型的CRISPR/Cas 對于充分認識和利用這類系統很有必要。譬如，利用RNA-seq 技術，有人在不同的微生物發現新的CRISPR位點；有人則用RNA-seq 探索了CRISPR RNA 的加工（processing）和調節機制。也有作者利用高通量測序技術研究了CRISPR位點間隔區（spacer）的獲取機制。
五．結語
新一代測序技術和CRISPR/Cas9基因組編輯技術，是進入二十一世紀十幾年來先后發展出來的兩項影響較大的遺傳學研究技術。像PCR技術一樣，兩者已經大大推動了生命科學相關領域的研究。在科研中將兩者有效地聯用，不但可以帶來事半功倍的效果，也有助于解決許多懸而未決的技術問題。
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