DNA甲基化是基因組DNA的一種主要表觀遺傳修飾形式。近年來,大量研究表明DNA甲基化修飾對于維持正常細胞功能、傳遞基因組遺傳印記、胚胎發育以及人類腫瘤發生,起著至關重要的作用,由此甲基化研究成為表觀遺傳學,乃至生命科學研究的熱點領域。
那么如何檢測單個基因或者全基因組的甲基化水平或者甲基化位點呢?
當前科研領域最常用的檢測方案是使用亞硫酸鹽將DNA中未甲基化的胞嘧啶(C)轉化為尿嘧啶(U),而甲基化的胞嘧啶則保持不變,通過設計特異性的甲基化引物,進行甲基化特異性-PCR或者亞硫酸鹽測序法,從而達到實驗目的。那么如何確保DNA中未甲基化的胞嘧啶100%完成了轉化,轉化過程中防止DNA降解,以及轉化后DNA的有效回收成了其中關鍵!
許多研究人員都會在亞硫酸氫鹽轉化之前富集甲基化的DNA。一來可降低背景,二來也可節約成本。目前有兩種基本方法,一個是利用5’-甲基胞嘧啶的抗體來捕獲甲基化DNA,即甲基-DNA免疫沉淀(MeDIP);另一個是利用包含了甲基-CpG結合結構域(MBD)的蛋白來得到同樣的結果。
目前市場上的大部分產品都是利用后一種方法。這兩種方法的差別在于MeDIP是在單鏈DNA的背景下特異識別5’-甲基胞嘧啶,而后者更偏愛雙鏈DNA。MBD的另外一個優勢是:在利用蛋白酶K將免疫沉淀后的DNA洗脫下來時,MBD2中的甲基化DNA可根據鹽梯度而逐步釋放。這樣,你就能區分不同程度的甲基化DNA。
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(EpiMag HT (96-Well) Magnetic SeparatorCat#Q10002-1)
Figure.2 試劑盒操作流程示意圖 Figure.3 轉化后DNA,qPCR驗證的效果圖
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