作者：Suzanne kennedy 來(lái)源：美國(guó)MoBio實(shí)驗(yàn)室【字號(hào)：大 中 小】

我們?cè)诋a(chǎn)品研發(fā)過(guò)程中需要收集大量各種各樣的樣品，然后找出最佳的微生物DNA提取方法。所以當(dāng)我們開(kāi)發(fā)PowerLyer的操作流程的時(shí)候，希望能找到適合各種樣品的一套方法。我們之前在研究均質(zhì)研磨和研磨珠套管的時(shí)候就知道，根據(jù)土壤類(lèi)型不同選擇合適的研磨珠可以增加DNA的得率。所以我們決定使用PowerLyzer做一個(gè)類(lèi)似的研究去回答一個(gè)問(wèn)題：在強(qiáng)力珠磨研磨機(jī)上使用一樣的操作流程對(duì)不同類(lèi)型土壤DNA得率和完整性結(jié)果是否一樣？很多人通過(guò)查閱參考文獻(xiàn)找他們一樣的土壤類(lèi)型的提取方法流程，然后毫無(wú)優(yōu)化改變地照搬。可是，一個(gè)提取方法能通用于所有類(lèi)型土壤嗎？

在前面的文章《DNA提取 I：土壤的分子生物學(xué)特性》，我們對(duì)土壤的裂解均質(zhì)有了全面的了解。今天，我用實(shí)例來(lái)回答這些問(wèn)題。我們使用高速研磨機(jī)（PowerLyzer）對(duì)比了兩種不同類(lèi)型土壤的DNA得率和完整性，其中一個(gè)粘土含量高，一個(gè)有機(jī)碳含量高；還加入了兩種不同研磨珠：0.1mm玻璃研磨珠（貨號(hào)13118）和0.7mm石榴石研磨珠（貨號(hào)13123）。結(jié)果很讓人驚訝。

研究方法:

我們收到了來(lái)自加利福利亞州立大學(xué)土壤研究中心的不同類(lèi)型土壤樣品，并選擇了粘土含量差不多而有機(jī)碳含量有差異的兩種土壤。其中一種含粘土45%，有機(jī)碳2.5%；另一種含粘土40%，有機(jī)碳高達(dá)5%。有機(jī)碳含量越高，生物量越多，意味著最終DNA得率越高。

為了做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，選擇了PowerSoil DNA Isolation Kit的0.7mm石榴石研磨珠和PowerLyzer PowerSoil DNA Isolation kit的0.1mm的玻璃研磨珠。在PowerLyzer上從2000 RPM起到最大轉(zhuǎn)速5000RPM，做系列研磨試驗(yàn)。每個(gè)樣研磨45s。

PowerSoil試劑盒提取的DNA用Nanodrop分光光度計(jì)測(cè)量含量，跑電泳檢查完整性。把玻璃研磨珠做的結(jié)果用藍(lán)色標(biāo)記，石榴石研磨珠做的結(jié)果用紅色標(biāo)記，做成下面的條形圖。

結(jié)果：

粘土，低有機(jī)碳含量土壤：

從第一個(gè)圖看得出來(lái)，高粘土含量土壤得率更高。我們可以看到玻璃研磨珠在3900-4200RPM的時(shí)候可以獲得最高DNA得率（條帶14、16）。很有趣的是，當(dāng)研磨速度超過(guò)4200RPM時(shí)，得率不升反降。證明，對(duì)土壤樣品研磨過(guò)頭，反而會(huì)導(dǎo)致DNA的損失。就是說(shuō)，獲得最高得率的DNA，有個(gè)研磨速度和時(shí)間上限。

我們還能看到，在低于3900RPM的時(shí)候，研磨珠和石榴石提兩種土壤樣品的DNA得率都差不多，為什么會(huì)出現(xiàn)這種情？

有個(gè)理論解釋說(shuō)，土壤中含量?jī)煞N主要成分：容易被裂解的、很難被裂解的。低速研磨的時(shí)候兩種研磨珠都輕易磨開(kāi)容易裂解的成分，而3900rpm的情況下玻璃研磨珠把另一個(gè)子集也裂解了。這部分可能是真菌和孢子。

可是，研磨太過(guò)的時(shí)候前面獲得的DNA就會(huì)被嚴(yán)重破壞降解，造成后面的低得率。

疏松高有機(jī)碳含量土壤

第二個(gè)圖是一個(gè)高有機(jī)碳含量的相似土壤做的一樣實(shí)驗(yàn)。粘土成分高達(dá)40%，雖然沒(méi)有第一個(gè)樣品45%的粘土含量高卻得到不同的結(jié)果。

石榴石研磨珠、玻璃研磨珠在開(kāi)始的時(shí)候DNA得率都差不多。但當(dāng)?shù)搅?200-3500RPM以后，石榴石的表現(xiàn)則要好于玻璃研磨珠。可是在電泳上卻看到DNA破損相對(duì)嚴(yán)重一些。斷裂的DNA片段推高了OD值而會(huì)被誤以為得率升高。所以我們一直建議最好測(cè)OD的同時(shí)結(jié)合跑電泳評(píng)估檢查DNA。

還有很多原因?qū)е翺D值不能完全反映真實(shí)DNA得率，請(qǐng)看此文Popular Misconceptions about DNA Isolation and Quantification。

對(duì)于這種土壤類(lèi)型，總的來(lái)說(shuō)DNA得率還算高。使用石榴石研磨珠在一系列速度上都能獲得理想的DNA得率，并且在4200RPM達(dá)到峰值，往后得率不隨速度提高而增加。這些數(shù)據(jù)證明，速度和時(shí)間已經(jīng)到達(dá)極限，不能提取到更多DNA了。

總結(jié)：

1- 上述數(shù)據(jù)告訴我們，土壤類(lèi)型多樣，每種都有自己獨(dú)特的特性。沙灘砂土樣品的提取肯定跟森林土壤不一樣，每個(gè)粘土樣品之間可能會(huì)有差異性表現(xiàn)。土壤樣品質(zhì)地的一致性、生物豐度不同、有機(jī)物含量不一等都會(huì)影響到最終你能獲得多少DNA和選擇的研磨方法。

2- 跑電泳結(jié)合測(cè)OD是最重要最常用的土壤DNA評(píng)估方法。使用PowerSoil DNA Isolation Kit提取土壤樣品，只會(huì)提取出來(lái)DNA，不帶任何RNA。市面上其它方法會(huì)連同RNA一起提取出總核酸，大大推高OD值，錯(cuò)誤地以為提取過(guò)程很成功。可以通過(guò)跑電泳檢測(cè)DNA的完整性，從而知道研磨力度不夠還是有點(diǎn)過(guò)了。

3- 因?yàn)槊總�(gè)土壤類(lèi)型都不一樣，有必要通過(guò)一系列不同速度、研磨時(shí)間，甚至采用不同類(lèi)型研磨珠來(lái)做預(yù)實(shí)驗(yàn) 。PowerSoil Kit我們建議從4000RPM 45s開(kāi)始，因?yàn)檫@個(gè)速度和時(shí)間對(duì)于采用兩種不同研磨珠和大多數(shù)土壤類(lèi)型樣品來(lái)說(shuō)是最合適的。不過(guò)也許你想把速度調(diào)低或調(diào)高，取決于樣品中孢子含量和微生物豐度。嘗試不同速度做一系列實(shí)驗(yàn)就能知道，你的樣品在哪個(gè)速度能獲得最多高質(zhì)量DNA。

加利福利亞州立大學(xué)的Chris Kitts lab與我們共同參與了此項(xiàng)研究。該校學(xué)生完成了五個(gè)不同類(lèi)型土壤分別用Vortex與PowerLyzer，石榴石研磨珠與玻璃研磨珠提取的DNA的t-RFLP分析。點(diǎn)擊查看相關(guān)海報(bào)。

最后，還是建議在啟動(dòng)一個(gè)新的項(xiàng)目之前，用你的研磨機(jī)做一個(gè)線性速度研究。看看之前做土壤使用的實(shí)驗(yàn)方案是否合適，對(duì)新樣品是否需要進(jìn)一步優(yōu)化。不同土壤特性獨(dú)一無(wú)二，前期多花點(diǎn)時(shí)間保障后面獲得寶貴數(shù)據(jù)是值得的。