多數細胞系和原代細胞都會以一種單層的形式生長（單層細胞）或者覆蓋在玻璃或經處理的塑料物體表面。為了保持細胞的健康與活躍增殖，通常需要對細胞進行有規律的傳代。

最常見的傳代方法是使用蛋白酶如胰酶或膠原酶破壞細胞間以及細胞與培養介質間的連接。當細胞被解離成單細胞懸液時，再將它們稀釋并分發至新的培養容器中。在那里，細胞可以重新貼壁生長和分裂，然后經過一段時間培養，細胞又再一次長滿（接近匯合）。此時，細胞又需要進行傳代或用于下游實驗。
注意：以下指南描述了典型單層細胞的常規傳代與維持的基本原則。為了得到一致的結果，堅持良好的培養記錄非常重要，記錄應包括細胞傳代的日期和傳代的次數。
細胞的檢查：應該養成良好的習慣對細胞進行常規的和認真的檢查，以了解它們的狀態和健康情況。

首先，用肉眼檢查培養容器中是否存在可見的微生物污染，比如培養基pH改變、渾濁或有顆粒樣的物體。同時也要注意觀察有沒有小的真菌菌落，因為它們在顯微鏡下不易被發現。這些菌落可能會飄浮在液體表面，特別是在培養容器周邊附近。
其次，在倒置顯微鏡下觀察細胞常規形態和生長狀態，留意檢查任何鏡下可見的微生物污染的跡象。在某些細胞系中，培養液中漂浮的細胞通常是死亡的細胞。但是，許多細胞在進行有絲分裂的時候也會變圓，形成折光性很強（很亮）的球體，并且在受到擾動后也會飄浮起來。兩者的區別在于，死細胞通常會變圓脫落但一般折光性不會很強。

除了這些日常檢查外，還需要對細胞進行周期性的真菌、細菌以及支原體檢查。
培養液的準備：準備針對特定細胞系在購買或文獻中推薦使用的新鮮培養液，并用記號筆在培養容器上標記傳代時間和細胞代數等信息。確保添加了補充成分（如：谷氨酰胺、生長因子、抗生素等）并且預先放置培養箱進行了pH平衡。一個75cm²的培養瓶大約需要12-15ml培養液，如何使用其他規格的培養容器需要進行相應的調整。

收集細胞：

大多數的細胞在完全生長匯合前（還有一些生長的空間）進行細胞傳代，可以達到最佳的生長狀態，因為此時細胞是處在活躍的對數生長期。實驗中觀察到的任何異常現象都應該被記錄在每個細胞系特定的記錄本上。

細胞的最佳收集方法的制定原則是以最輕柔的方式破壞細胞與培養容器以及細胞之間的連接。對于大多數細胞而言，這就需要使用含化學試劑或酶的消化液。胰酶是最常用的消化液，它的常規用量在0.05%到0.25%之間。胰酶的最佳工作濃度通常是指可在較短時間內（10-15min），使細胞從培養容器壁上脫落形成單細胞懸液的最低濃度。某些細胞相對其他的細胞更難以消化，此時通常在胰酶中還需要添加膠原酶或螯合劑如EDTA等，以提升消化能力。
當細胞生長在含哺乳動物源性血清的培養液時，細胞需要首先進行清洗以除去血清，因為血清的存在會抑制胰酶的活性。血清殘留是胰酶消化失敗的常見原因。細胞消化時，要求使用不含鈣和鎂離子的緩沖液，因為這兩種離子在細胞間以及細胞與培養容器間的吸附中發揮重要作用。
單層細胞的收集：

1.去除細胞培養液
2.加入5ml消化液清洗細胞一次，然后吸除（該方法的試劑用量是針對75cm²培養瓶，如果使用其他培養容器需要適當的增加或減少試劑的用量）。如果消化液中包含胰酶，就需要清除所有的血清殘留，因為血清中含有胰酶抑制劑。（注：這里也可以使用DPBS清洗1-2次，節約點消化液）
3. 加入2-3ml消化液，每隔5min在倒置顯微鏡下觀察細胞的消化情況。對于特別難以消化的細胞，可以在37度進行消化。對消化液進行預熱可以減少消化時間，為了避免細胞成團，在等待細胞脫落的過程中不要敲擊或搖晃培養瓶。
4. 使用移液管向細胞懸液中加入6-8ml生長培養液，吹打培養瓶底部收集所有殘留的細胞。此時，在倒置顯微鏡下進行簡單觀察應該看到細胞懸液中至少95%的細胞為單細胞。如果不是，可能需要進一步進行吹打。
5. 收集細胞懸液，按需求進行細胞計數或者等分，然后分發至準備好的培養容器中。對于一些細胞系或者酶消化液（膠原酶），在分發之前有必要通過輕柔的離心（125g，5min）去除酶消化液。
細胞的計數或等分：

為了得到細胞的生長速率或者按已知的濃度接種細胞，就需要對細胞懸液進行計數，我們可以使用血細胞計數器或電子細胞計數器。血細胞計數器的優點是比較便宜，而且可以同時檢測細胞的活率。輕輕混勻細胞懸液，取出0.5ml進行細胞計數。向其中加入0.5ml活細胞染色液如臺盼蘭（trypan blue）或赤蘚紅B（erythrosin B），充分混勻，取出部分樣品，小心加入干凈的血細胞計數器中。
計算細胞懸液中細胞的實際濃度（每毫升懸液中的細胞數）以及細胞的活率，然后計算為了達到合適的傳代密度需要使用的懸液體積。除了細胞計數，細胞懸液也經常按傳代培養瓶的數量進行等分。例如，1：2傳代意味著將一個培養瓶中得到的細胞懸液等分至兩個新的等培養面積的培養瓶中，該法適用于細胞的精確密度不是非常重要時的常規細胞傳代。
細胞的接種：

分發合適的細胞懸液至事先準備好的細胞培養瓶中（將高濃度的細胞懸液直接加入空的培養瓶會導致細胞的不均勻貼壁和生長）。對于生長快速的細胞，接種的密度可以低一些。然而，有些細胞在低于一定接種密度時，生長的不好。但多數細胞在起始密度為10³-10⁴細胞每平方厘米或更高（每個75cm²培養瓶接種7.5×10⁴到7.5×10⁵個細胞）時都可以生長的很好。

細胞的培養：

將細胞放回培養箱，大多數的哺乳動物細胞在35度到37度的恒溫下生長的最好。除了維持穩定的溫度，對于非封閉的培養容器如Dish或多孔板，培養箱還需要維持較高的濕度和CO₂水平。高濕度可以防止培養容器中的液體揮發損失，進而導致的培養液濃縮引起的高滲透壓。
當培養液使用的是含適量的NaHCO₃的緩沖系統時，提升CO₂的水平（通常為5%-10%）可以使培養液維持在一個合適的pH范圍（7.0-7.6）。為了使此類緩沖系統可以正常的工作，需要使用非密封（瓶蓋旋松）或氣體可透過的培養瓶以保證正常的氣體交換。如果沒有可用的CO₂，有一種緩沖系統可以在封閉的培養容器中維持培養液處在合適的pH范圍。
傳代次日進行鏡下觀察，確保細胞已經重新貼壁并活躍增殖。培養期間按要求進行換液，對于大多數活躍增殖的細胞來說，通常一周需要換液2-3次。

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胰蛋白酶：http:///cn/br/Cytokines%20and%20proteins/03/P141442.htm        

赤蘚紅erythrosin   http:///cn/br/bm/01/P266235.htm