斯坦福大學醫學院的遺傳學教授Michael Snyder及其同事利用Pacific Biosciences系統，對三個家庭成員的類淋巴母細胞轉錄組進行了測序，并將獲得的reads與Illumina平臺上獲得的較短reads進行比較。通過這些轉錄組，他們開發出一名家庭成員的等位基因特異的全長轉錄組。

斯坦福大學的研究人員利用一種基于long-read的方法，生成了個人的轉錄組。這項成果于近日發表在《美國國家科學院院刊》上。

文章的通訊作者是斯坦福大學醫學院的遺傳學教授Michael Snyder。他的實驗室主要利用各種方法來分析基因組及調控網絡。他們的研究對象包括酵母和人類。Snyder教授曾在《Cell》、《Science》、《Nature》等雜志上發表了多篇具有影響力的文章。

在這項研究中，Snyder及其同事利用Pacific Biosciences系統，對三個家庭成員的類淋巴母細胞轉錄組進行了測序，并將獲得的reads與Illumina平臺上獲得的較短reads進行比較。通過這些轉錄組，他們開發出一名家庭成員的等位基因特異的全長轉錄組。他們能夠區分兩個等位基因，即使是復雜的基因如HLA。
 
研究人員在文章中寫道：“據我們所知，我們生成了最深且最長的單分子long-read數據集。”他們認為，這種個人的轉錄組，將對了解個體生物學和疾病很重要。

Snyder及其同事利用PacBio平臺，對GM12878細胞系的大約711,000個環化一致分子（circular consensus read molecules）進行測序。他們產生了較長的reads（平均讀長為1,188 bp），這比去年他們在《Nature Biotechnology》上展示的人體器官panel的數據集更長（平均讀長為999.9 bp）。
 
他們也指出，盡管兩個數據集都同樣產生了較短的分子（長度介于0.8 kb和1.3 kb），但是現有的數據集更好地代表了長于1.7 kb的分子。
此外，這個斯坦福的團隊也在Illumina的平臺上對100 M個101 bp的雙端reads進行測序，并利用Cufflinks開展分析。
 
這兩種技術都發現了約99,000個帶注釋的外顯子-外顯子接頭，且Illumina的reads發現了額外92,000個注釋接頭，而PacBio的reads發現了額外992個。此外，對于22,600個被Gencode歸為蛋白編碼基因或lincRNA的剪接基因，long-read的單分子測序和101 bp的雙端測序同時鑒定出其中的9,200個。long-read還發現了40個基因，雙端測序發現了6,400個基因，而還有7,000個基因利用兩種方法都未發現。

研究人員推測，由于環狀一致read的產生需要讀長至少是cDNA長度的兩倍，故consensus split-mapped molecules（CSMM）不包含大量較長的基因。
 
研究人員表示，轉錄組學研究的目標是能夠指定表達RNA分子的等位基因。他們認為，long-read測序應該能夠確定影響單個RNA分子的每個SNV。

為了追蹤在GM12878子細胞系中發現的這些等位基因的來源，他們合并了GM12891和GM12892母細胞系的數據，并研究了子代中存在的SNV是否存在于親代數據中。
 
通過主成分分析，他們能夠分離出兩個等位基因。對于166個注釋有兩個雜合SNP的基因，研究人員發現其中的158個有兩個或以上的SNP，2個基因有一個SNP，而6個基因似乎不是雜合的。

一些基因，尤其是HLA基因，包含多個SNP，而對于它們，研究人員基本能夠確定相位。“即使是復雜的基因（如HLA基因，其序列可能與參考序列相差甚遠），兩個等位基因通常也是清晰可辨的，”Snyder及其同事寫道。
 
原文檢索
Defining a personal, allele-specific, and single-molecule long-read transcriptome
Published online before print June 24, 2014, doi: 10.1073/pnas.1400447111 PNAS June 24, 2014

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