限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment lengthpolymorphism,RFLP）分析技術是分子生物學的重要分析方法之一，用于檢測DNA序列多態(tài)性。PCR-RFLP 是將PCR技術、RFLP 分析與電泳方法聯(lián)合應用，先將待測的靶DNA 片段進行復制擴增，然后應用DNA限制性內(nèi)切酶對擴增產(chǎn)物進行酶切，最后經(jīng)電泳分析靶DNA 片段是否被切割而分型。

本實驗將應用RFLP 分析技術檢測NMDA 受體中的GRIN2A 亞基基因3 號內(nèi)含子中的2 個SNP 位點rs17750303（A→C）和rs837690（A→G）。

[實驗原理]

DNA 限制性內(nèi)切酶具有識別特定的DNA 序列并在特定的部位切斷DNA 雙鏈的活性功能，DNA分子由于突變（核苷酸的置換、插入或缺失）改變（或形成）了限制性內(nèi)切酶識別序列，使DNA 限制性內(nèi)切酶不能（或可以）將靶DNA片段切斷，電泳檢測時，存在相應DNA 限制性內(nèi)切酶識別序列者原DNA 片段變成短片段；不存在相應DNA 限制性內(nèi)切酶識別序列者原DNA 片段長度將不發(fā)生變化。

[實驗器材]

PCR 擴增儀、電泳儀、電泳槽、微波爐、恒溫箱或恒溫水浴等。

[實驗試劑]

限制性內(nèi)切酶BstNI、模板DNA、Taq聚合酶、PCR引物（上游引物:5－CTAAGCCTTCCCTTTATCACC－3’；下游引物：5－TTCACAGTCGTGCTTGTTTCT－3’）、、酶消化緩沖液、電極緩沖液、上樣緩沖液等。

[實驗方法]

1.PCR擴增：PCR反應體系為20μl，含模板2μl(約50ng)，引物各1.6μl，dNTP1.6μl(0.4mM)，10×Buffer緩沖液2μl，Taq酶0.5U，加雙蒸水至20.0μl；PCR反應條件為95℃2min，94℃30sec/64℃30sec/72℃30sec(5個循環(huán))，94℃30sec/63℃30sec/72℃30sec(5個循環(huán))，94℃30sec/60℃30sec/72℃25sec(23個循環(huán))，94℃30sec/60℃30sec/72℃1min。

2.PCR 擴增產(chǎn)物的檢測：取PCR 擴增產(chǎn)物2μl，以1%的瓊脂糖凝膠潛水電泳法檢測靶DNA 片段的擴增產(chǎn)物。

3.酶消化反應：取PCR 產(chǎn)物約2.0μl，加限制性內(nèi)切酶BstN I1U，10×酶消化反應緩沖液1.0μl，蒸溜水補至10.0μl 置試驗管中。37℃溫箱中孵育4h。

4.酶切產(chǎn)物電泳分型：6%聚凝膠電泳（T=6%，C=3.3%，凝膠規(guī)格為82mm×64mm×0.75mm）。電極緩沖液為1×TBE。將加有1/5體積上樣緩沖液的酶切產(chǎn)物電泳，220 v 電壓，電泳2－3h。

5.銀染顯色將凝膠剝離至染色盤中，用10%冰醋酸固定30min,去除固定液，用蒸餾水沖洗凝膠3 次（2min以內(nèi)）。將0.1%硝酸銀溶液200ml 倒入染色盤中，染色30min，倒掉染色液，蒸餾水快速沖洗凝膠1 次（20s以內(nèi)）。顯色液200ml（3% Na2CO3，含0.05%甲醛，2‰Na2S2O3）倒入染色盤中，不斷震蕩，直至譜帶顯示清晰。用固定液終止顯色。蒸餾水洗滌一次，貼于濾紙上晾干保存。

[結果判定]

本實驗PCR 產(chǎn)物長度為379bp，rs17750303 位點位于140bp 處，為A/C突變。rs837690 位點位于175bp處，為AG 突變。兩個位點均為BstN I 酶識別部位，酶切后可以產(chǎn)生1-4（6 種）個DNA 片斷，根據(jù)酶切片段數(shù)量與長度可出現(xiàn)10 種譜型（基因型組）見下表。

根據(jù)酶切片段數(shù)量與長度確定rs17750303－rs837690 位點基因型組合

GRIN2A 基因rs17750303 與rs837690 位點的RFLP 電泳譜型

1.DNA 長度標準品；2.PCR 擴增產(chǎn)物；3.AA-AA 型；4.CC-AG 型；5.AC-AA型,；6.AC-GG 型，；7.CC-AA型；8.CC-GG 型；9.AA-GG 型；10.CA-AG 型。

[實驗討論]

1.注意事項 ①靶片段的擴增產(chǎn)物要純，如有非特異產(chǎn)物（特別是大片段可能含有酶識別序列）將競爭酶活性，使樣品消化不完全或及出現(xiàn)酶消化雜帶；②酶消化過程要充分（即底物與酶的比例要合適，消化時間要保證），避免假陰性結果；③酶切陽性結果可以確定所檢測具體序列，陰性結果僅可說明非酶識別序列，但不能準確判定具體序列。④酶識別序列如有甲基化之核苷酸將不被切割。

2.方法評價 該方法操作簡單，結果容易判定。