核酸限制性內切酶 是一類能識別雙鏈ＤＮＡ中特定堿基順序的核酸水解酶，這些酶都是從原核生物中發現，它們的功能猶似高等功物的免疫系統， 用于抗擊外來ＤＮＡ的侵襲。
限制性內切酶 以內切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵， 產生的ＤＮＡ片段５’端為Ｐ，３’端為ＯＨ。
1. 限制性內切酶的類型
根據限制酶的識別切割特性， 催化條件及是否具有修飾酶活性可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。
第一類（I型）限制性內切酶能識別專一的核苷酸 順序，它們在識別位點很遠的地方任意切割DNA鏈，但是切割的核苷酸 順序沒有專一性，是隨機的。這類限制性內切酶在DNA重組技術或基因工程中用處不大，無法用于分析DNA結構或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等。
第三類（III型）限制性內切酶也有專一的識別順序，在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對也不是特異性的。因此，這種限制性內切酶切割后產生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。因此也不能應用于基因克隆。
第三類（Ⅱ型）限制性內切酶就是通常指的ＤＮＡ限制性內切酶.
它們能識別雙鏈ＤＮＡ的特異順序，并在這個順序內進行切割，產生特異的ＤＮＡ片段；
Ⅱ型酶分子量較小，僅需Mg2+作為催化反應的輔助因子，識別順序一般為４～６個堿基對的反轉重復順序；
Ⅱ型內切酶切割雙鏈ＤＮＡ產生３種不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。
正是得益于限制性的內切酶的發現和應用， 才使得人們能在體外有目的地對遺傳物質ＤＮＡ進行改造，從而極大地推動了分子生物學的興旺和發展。
粘性末端：是交錯切割，結果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。
如EcoRI的識別順序為：
5’…… G|AATTC ……3’
3’…… CTTAA|G …… 5’
在雙鏈上交錯切割的位置切割后生成
5’……G AATTC……3’
3’……CTTAA G……5’
各有一個單鏈末端，二條單鏈是互補的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過DNA連接酶 的作用而“粘合”。

平頭末端：
II型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈，產生平頭末端。例如EcoRV 的識別位置是：
5’…… GAT|ATC …… 3’
3’…… CTA|TAG …… 5’ 　
切割后形成
5’…… GAT ATC …… 3’
3’…… CTA TAG …… 5’
這種末端同樣可以通過DNA連接酶 連接起來。

2. 限制性核酸內切酶的命名法
用屬名的頭一個字母和種名的頭兩個字母表示寄主菌的物種名稱，如E. coli 用Eco表示，所以用斜體字。
用一個字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。
如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個不同的限制與修飾酶，則以羅馬數字表示，如HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。