基因組DNA文庫構建必備實驗技巧
基因組DNA文庫用途十分廣泛，如用于人類及動植物基因組學研究，基因表達調控研究，分析、分離特定的基因片段等。通常情況下，基因組文庫構建的基本流程可以歸為四大步驟：分離基因組DNA、對基因組DNA作相關的處理、將基因組DNA片段連接入載體、將重組載體轉入宿主細胞。
一、分離基因組DNA（gDNA） 毫無疑問，高質量的基因組DNA對于基因組文庫構建是至關重要的。需要通過經驗來選擇合適的基因組DNA 分離方法，在分離 過程中保證DNA不被過度剪切或降解，同時也要盡量保證DNA的純度。二、處理基因組 DNA
根據研究目的，研究者需要選擇合適的載體。不同的載體對基因組DNA的長度有不同的要求，必須選擇合適長度的基因組DNA來構建基因組文庫。比如，對于黏粒載體，合適的片段長度大約為40kb；對于BAC載體，合適的片段長度平均為120kb-300kb。
構建黏粒基因組DNA文庫，需要將基因組DNA用注射器抽打來隨機剪切DNA；接著用末端修復酶修復DNA，可以提高DNA連接入載體的效率；然后通過脈沖場電泳或者普通電泳來找到40kb左右的DNA片段，隨后使用膠回收試劑盒回收DNA。
構建BAC基因組DNA文庫，需要將基因組DNA用限制性內切酶 （常用EcoR I、BamH I或者Hind III）來消化基因組DNA，然后通過脈沖場電泳找到合適長度的DNA片段（比如100kb-150kb），隨后透析回收DNA。
需要注意：
（1）電泳時，要選用合適的DNA Ladder，以保證電泳后可以準確定位所需分子量的DNA。
（2）電泳以后，應盡量縮短用紫外光照射目標DNA的時間，否則會顯著降低克隆效率。
（3）回收DNA的時候，應該要避免過度離心，以防止DNA被剪切，降低文庫質量。
三、載體的選擇
目前，常用的基因組文庫載體有黏粒載體、P1噬菌體載體、PAC載體（P1人工染色體）、BAC載體（細菌人工染色體 ）和YAC載體（酵母人工染色體）。選用何種載體可以參考如下幾個因素：
1、目標區域的大小：
如果基因組的目標區域很小（小于50kb），那么可以選擇黏粒載體甚至λ噬菌體載體。利用現有的商品化的黏粒載體、高效率的包裝混合物和合適的大腸桿菌菌株，可以方便的構建黏粒載體文庫。
如果基因組的目標區域比較大，那么P1、PAC或者BAC就比較合適了。P1操作比較困難，PAC相對簡便。BAC載體也是很好的選擇，可以利用現有的成熟產品來構建BAC文庫，比如商業化的一系列BAC載體及配套試劑盒。
如果目標區域非常大（大于250kb），那么YAC載體就是首選了。不過，應用YAC載體來構建基因組文庫，操作非常繁瑣困難。
表1 各種載體的比較
| 載體 | 容量（kb） | 宿主 | 導入細胞方式 |
| 黏粒 | 30-45 | 大腸桿菌 | 轉導 |
| P1 | 70-100 | 大腸桿菌 | 轉導 |
| PAC | 130-150 | 大腸桿菌 | 電轉 |
| BAC | 120-300 | 大腸桿菌 | 電轉 |
| YAC | 250-400 | 酵母 | 轉化 |
黏粒載體一般使用傳統的濾膜影印雜交來篩選，但是這種方法對于構建區域圖譜及疊連群來說既費力又浪費。大容量載體文庫，如P1、PAC、BAC、YAC，以二維陣列保存，既可以用傳統的單拷貝的探針雜交法篩選，又可以用PCR進行多克隆的群體篩選。而且，使用高容量載體構建文庫，可以減少染色體步查的步驟。
3、 載體拷貝數的考慮：
當把大片段DNA片段克隆到高拷貝的載體時，克隆DNA會發生重組，從而影響克隆序列的保真性和穩定性；而單拷貝載體的低產量DNA是高通量分析的瓶頸。對這一矛盾的解決方案可采用EPICENTRE公司的CopyControlTM 克隆系統，CopyControlTM 技術整合了單拷貝載體與多拷貝載體的優點。單拷貝載體能提高插入片段的穩定性，而且能在誘導劑的作用下，即時擴增出高拷貝數的克隆而獲得高產量的DNA。
四、將基因組 DNA 片段連接入載體
使用連接酶 把上述大小合適的DNA片段連接入載體。許多商業化載體已經經過預處理，可以直接使用，無需內切酶消化及脫磷酸化處理。選用連接快、效率高的連接酶 ，連接反應體系以100μl為宜。
注意：BAC載體連接完以后，需要將連接產物做脫鹽處理，除去連接反應緩沖液里的鹽分。
五、將重組載體轉入宿主細胞
如果構建黏粒文庫，需要用包裝蛋白來包裝上述的連接反應產物，測定包裝好的黏粒克隆的滴度，然后轉染。挑出重組子，鑒定插入片段的大小。如果文庫的大小和質量都令人滿意的話, 就可以鋪板進行文庫篩選，或者擴增、保存文庫。
如果構建BAC文庫，應選擇電轉法，將上述連接產物轉入受體菌，涂板長出克隆。獲得克隆后需要對BAC克隆的大小進行評估，確定文庫大小是否能夠滿足要求。如果文庫大小合適，就可以進行后續操作了。
六、文庫克隆數的確定
基因組DNA文庫需要包含足夠多的克隆，來保證文庫的代表性。一般使用如下的經驗公式來確定：
N = ln (1-P ) / ln (1-f ) P是希望得到的覆蓋率，f是插入片段大小與基因組DNA大小的比值，N是所需的克隆數。
舉例來說，用BAC載體構建人類基因組文庫，人類基因組大小為3 x 109 bp, 插入片段大小為100kb，希望覆蓋率99%，那么所需要的BAC克隆數為
N = ln (1 - 0.99) / ln (1 - [106 bp / 3 x 109 bp]) = 138,298
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