論文摘自山東師范大學(xué)化學(xué)化工與材料科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250014

摘 要 熒光顯微鏡與熒光光譜儀耦合系統(tǒng)可獲取顯微熒光成像及微區(qū)熒光光譜、熒光壽命的測(cè)定信息，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞、組織中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能分析，核酸的識(shí)別檢測(cè)，金屬離子、自由基的定量測(cè)定，以及納米生物探針的研制等生物分析研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。

1 引 言
熒光顯微鏡在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已得到了廣泛應(yīng)用，是觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生命現(xiàn)象的有力工具。熒光顯微鏡作為一種必不可少的分析手段，常用于定性觀察細(xì)胞內(nèi)部熒光物質(zhì)的空間分布和強(qiáng)度分布，得到細(xì)胞的熒光圖像，研究細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。然而熒光顯微鏡不能定量給出圖像發(fā)光的強(qiáng)度數(shù)值，無法研究細(xì)胞圖像發(fā)光強(qiáng)度變化不大或熒光物質(zhì)空間分布變化細(xì)微的生理過程。因此，隨著生物醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展，迫切需要有更高靈敏度，操作更快捷，功能更加完備的儀器來滿足生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究發(fā)展的要求。熒光顯微鏡與熒光光譜儀耦合而成的系統(tǒng)儀器能夠獲取顯微熒光成像及微區(qū)熒光強(qiáng)度、熒光壽命的測(cè)定信息。選擇熒光探針對(duì)被標(biāo)記物進(jìn)行特異性標(biāo)記，熒光探針的亮度即熒光強(qiáng)度可反映被標(biāo)記物相對(duì)含量的多少。熒光顯微鏡對(duì)圖像采集后，熒光光譜儀可測(cè)量圖像的熒光強(qiáng)度，對(duì)獲取的圖像進(jìn)行熒光強(qiáng)度的定量，為全面分析和研究細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)提供更加詳盡的數(shù)據(jù)信息。

2 熒光顯微鏡與熒光光譜儀耦合系統(tǒng)及特點(diǎn)
應(yīng)用單臂光纖連接熒光顯微鏡與熒光光譜儀，實(shí)現(xiàn)熒光光譜測(cè)量和細(xì)胞實(shí)時(shí)成像二維信號(hào)的同時(shí)采集。以高頻脈沖激光器作為激發(fā)光源激發(fā)顯微鏡下樣品，使之發(fā)射出可見范圍內(nèi)的波長(zhǎng)，呈現(xiàn)熒光映像。用熒光顯微鏡的物鏡收集信號(hào)，通過單臂光纖將耦合好的熒光信號(hào)從熒光顯微鏡傳導(dǎo)至熒光光譜儀，記錄熒光發(fā)射光譜。電感耦合相機(jī)（charged coupled device，CCD）攝像系統(tǒng)作為光電傳感器用于顯微鏡圖像獲取技術(shù)采集細(xì)胞圖像，并將圖像信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)輸入計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取及圖像處理，獲取微區(qū)熒光光譜掃描譜圖的詳細(xì)信息，并對(duì)圖像進(jìn)行采集、曝光調(diào)整、多色彩空間的影像編輯、預(yù)定義的影像設(shè)置、自動(dòng)調(diào)焦、自動(dòng)后處理加工調(diào)整，獲得色彩鮮艷、清晰度高的影像。應(yīng)用光纖耦合熒光光譜儀與熒光顯微鏡，配合熒光圖像掃描顯微熒光光譜及進(jìn)行微區(qū)熒光壽命的測(cè)定（超高時(shí)間分辨率，可得到復(fù)合物中不同組分的熒光壽命），優(yōu)化升級(jí)了作為單一儀器的功能。紅敏光電倍增管（PMT）和紅外PMT 切換使用滿足超寬光譜范圍探測(cè)（200 ～1700 nm），適合從紫外到近紅外波段熒光光譜的特性研究，為生物體系中近紅外熒光探針的開發(fā)應(yīng)用研究提供了有力的支持。

3 生物分析中的應(yīng)用
熒光探針是設(shè)計(jì)用來進(jìn)行生物標(biāo)本特定區(qū)域內(nèi)定位或?qū)μ囟ù碳し磻?yīng)的熒光團(tuán)，可以高度敏感性和選擇性的檢測(cè)復(fù)雜生物分子及活細(xì)胞中的特定成分。相對(duì)于常規(guī)熒光檢測(cè)而言，在近紅外光區(qū)，生物基體光吸收或熒光強(qiáng)度很小，且致密介質(zhì)（如組織）的光散射明顯降低，激發(fā)光的穿透性更強(qiáng)，因而自發(fā)熒光的背景干擾顯著降低。熒光探針由于其特殊的光物理和光化學(xué)特性而具有靈敏度高、動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍寬的優(yōu)點(diǎn)，且其測(cè)定條件適宜生命體的生理環(huán)境而被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域。設(shè)計(jì)近紅外熒光探針引入組織和細(xì)胞，富集在組織和細(xì)胞的特定成分中，在熒光顯微鏡下不僅可觀察固定的細(xì)胞、組織切片，還可對(duì)活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、生物大分子等進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察和檢測(cè)，配合熒光光譜儀獲取熒光圖像的量化信息。因此，熒光顯微鏡與熒光光譜儀耦合系統(tǒng)在生物分析領(lǐng)域中將具有廣泛的應(yīng)用前景。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能分析及核酸的識(shí)別檢測(cè)

生物體內(nèi)細(xì)胞的生理狀態(tài)受內(nèi)部和外部因素的影響，可通過基因表達(dá)和后續(xù)的蛋白質(zhì)表達(dá)表現(xiàn)出來。因此，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究是認(rèn)識(shí)生命過程的關(guān)鍵。活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的顯微熒光成像分析是生物顯微技術(shù)的一個(gè)重要方面。Dawn 等成功設(shè)計(jì)合成了活細(xì)胞中定點(diǎn)標(biāo)記N 端為半胱氨酸蛋白質(zhì)的一系列熒光分子探針。這種熒光分子探針利用生理?xiàng)l件下含硫代酸酯的小分子可有效穿過細(xì)胞膜與 N 端為半胱氨酸的蛋白質(zhì)進(jìn)行化學(xué)選擇性反應(yīng)產(chǎn)生熒光，跟蹤檢測(cè)蛋白質(zhì)的功能及相互作用。利用熒光顯微鏡觀察了探針標(biāo)記細(xì)胞的顯微熒光成像，根據(jù)熒光光譜確定探針的發(fā)射波長(zhǎng)處于近紅外波段，適用于活細(xì)胞中蛋白質(zhì)的熒光成像分析檢測(cè)。

生命活動(dòng)離不開酶的催化作用，機(jī)體內(nèi)的物質(zhì)代謝在酶的催化下有條不紊地進(jìn)行。酶是由活細(xì)胞合成的，是能夠?qū)μ禺惖孜锲鸶咝Т呋�作用的蛋白質(zhì)。基于熒光的酶分析方法隨著酶熒光探針的開發(fā)得以廣泛應(yīng)用，熒光顯微鏡常用于檢測(cè)熒光酶細(xì)胞化學(xué)的作用。為了研究某些細(xì)胞內(nèi)的生理過程，經(jīng)常將熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）與熒光顯微技術(shù)結(jié)合起來。Mupam 等就通過熒光顯微鏡、CCD 和熒光光譜儀來進(jìn)行完整細(xì)胞中 FRET 發(fā)生的定位，將細(xì)胞內(nèi)的理化反應(yīng)研究提高到細(xì)胞器的水平。Chi-wang等利用 FRET 工作原理設(shè)計(jì)的熒光探針包括一個(gè)對(duì)已知蛋白激酶特異性識(shí)別的底物結(jié)構(gòu)域，一個(gè)與磷酸化絲氨酸底物結(jié)構(gòu)相結(jié)合的磷酸化識(shí)別結(jié)構(gòu)域。當(dāng)?shù)孜锝Y(jié)構(gòu)被磷酸化后，分子內(nèi)部就會(huì)發(fā)生磷酸化識(shí)別結(jié)構(gòu)域與其結(jié)合而引起的內(nèi)部折疊，探針兩端兩個(gè)熒光蛋白相互靠近就會(huì)發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。熒光光譜提供分子發(fā)生磷酸化前后的熒光強(qiáng)度變化，熒光顯微鏡獲得 FRET 成像反映供體蛋白與受體蛋白之間的相互作用，做到活細(xì)胞內(nèi)定時(shí)、定量、定位地觀測(cè)蛋白激酶活性變化。

核酸是生命的信息物質(zhì)，對(duì)蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞分裂和復(fù)制以及生物遺傳起著重要作用。熒光探針技術(shù)具備方法簡(jiǎn)便，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合熒光顯微鏡應(yīng)用于核酸的定量分析、結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理的研究日益廣泛。分子信標(biāo)作為敏感、特異的核酸探針，通過空間結(jié)構(gòu)改變決定發(fā)射熒光特性，實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞中核酸的定位信息采集及定量檢測(cè)，利用分子信標(biāo)技術(shù)可以對(duì)生物大分子在活體內(nèi)的代謝等動(dòng)態(tài)過程進(jìn)行跟蹤分析。Santangelo 等設(shè)計(jì)了一對(duì)與待測(cè)目標(biāo) mRNA 序列互補(bǔ)的新型分子信標(biāo)，制成脂質(zhì)體使之?dāng)z入細(xì)胞，與目標(biāo) mRNA 雜化時(shí)產(chǎn)生 FRET，較之單一分子信標(biāo)有效抑制了主動(dòng)錯(cuò)誤信息的檢出，靈敏定量檢測(cè)目標(biāo) mRNA。應(yīng)用顯微注射法注入活體細(xì)胞獲取熒光顯微成像，檢測(cè)熒光強(qiáng)度實(shí)時(shí)反映活體 RNA 的代謝轉(zhuǎn)移過程。(更多信息請(qǐng)?jiān)L問精譜徠官網(wǎng)）