酵母質粒提取離心法操作步驟
酵母質粒提取離心法操作步驟：
1. 接種5 mL含有酵母攜帶所需質粒的YDP培養液，將其振蕩培養在30℃16-24小時。
2. 取1-3ml酵母培養菌體(使用< 2×107細胞)，室溫下5000× g離心5 min。
3. 棄培養液，收集菌體，加入480μL Buffer SE和30μL Lyticase solution。以最快的速度渦旋懸浮1min。充分懸浮細胞顆粒有助于提高得率。將其置于30℃消化30min左右。
注：在使用前確保β-mercaptoethanol已添加到Buffer SE (10µL /毫升)中，這種混合液可以在室溫很好的放置時間為1周。
4. 將混合液顆粒在4,000 x g室溫離心5min，棄上清完全。
5. 加入250 µL Buffer YPI重新懸浮混合液顆粒。
6. 加入50 mg 玻璃珠，然后以最快速度渦旋5min，讓樣品在玻璃珠作用下沉降穩定下來。轉移上清至一個1.5ml離心管中。
7. 加入250 µL Buffer YPII，反復顛倒混勻離心管4-6次以獲得干凈的溶解產物。將其室溫放置5 min。
注：此步應避免高強度混合，因為這將使染色體DNA斷裂以及降低質粒純度。YPII在存儲時要蓋緊蓋子。
8. 加入350µL Buffer YP III，用手大幅度顛倒混勻樣品直到形成絮凝白色沉淀。室溫下13,000 × g離心10min。
9. 將干凈的上清液小心轉移至DNA Mini Column，取上清時盡量不要打擾顆粒與沉淀。室溫下10,000 × g離心30s。倒掉廢液，將吸附柱重新插入收集管中。
10. 向吸附柱中加入500 μL Buffer KB，12,000 rpm轉離心30秒，棄收集管與廢液。
11. 將吸附柱放入一個新的收集管中，加入650 μL Wash Bufffer（確保已加入乙醇），12,000離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱重新插入收集管中。
注：Wash Buffer 用無水乙醇稀釋后使用。
12. 可選步驟：重復步驟11。
13. 13,000 rpm 開蓋離心2分鐘。
注：開蓋離心有助于去除殘留乙醇，乙醇的有效去除保證DNA的洗脫。
14. 將柱子放入一個新的1.5ml離心管中，向柱中加入50-100 µL Elution Buffer(10 mM Tris-HCL, pH 8.5)，室溫放置1 min，13,000 x g離心1 min進行洗脫。
可選步驟：第一次洗脫通常能得到75-80% DNA，用50-100 µL預熱(65°C) Elution Buffer再次洗脫DNA，第2次洗脫可收獲另外20%的DNA
標簽：
酵母質粒提取
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