Dr. Zhiping 與 Dr. Ami Citri合作，在操控人類胚胎和出生后的成纖維細胞轉變成功能性的神經元細胞（iN）的研究中取得突破性研究進展。

 

- 單細胞基因表達

 

- Biomark系統

- 48.48動態微流體整合芯片

 

美國斯坦福大學醫學院以轉化開創性醫學研究為病人提供優質護理而聞名。Dr. Zhiping（原分子和細胞生理學系博士后）和Dr. Ami Citri（精神病和行為學系博士后）結合他們的努力，與其他研究人員一道在Nature Protocols雜志上發表了題為Induction of human neuronal cells by defined transcription factors, Nature; and also Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells的文章。這篇文章和其他的相關操作流程描述了他們如何將干細胞和產后皮膚細胞轉變成神經（腦）細胞的工作。Dr Pang 說：“這些工作不僅在利用細胞模型研究人類神經疾病方面邁出了重要的一步，而且也將對解讀表觀遺傳學如何調控神經細胞的分化和成熟提供重要的參考。”

 

作者在文中測試了兩種假設：1）確定強制性表達的轉錄因子是否可誘導人類多能干細胞獲得神經元細胞特性，2）非神經元的人成纖維細胞是否也可被轉換成神經元。Citri博士說：“zhiping來找我，他需要這個項目能夠在單細胞水平上評估細胞群落中的多樣性。”他說：“要評估轉換成神經細胞的效率，成熟細胞的水平以及轉化后獲得特定的神經細胞的屬性都是理解從其他細胞誘導成神經元細胞的基礎。因此我們建立了一個流程，利用Fluidigm的動態整合微流體芯片來評估單個神經元。我們從一組相對大量的單細胞樣品中，檢測了一套膠質生物標記、神經元標記或成纖維細胞的標記物以評估神經元的轉換過程的效率和特異性。我們從小鼠神經元細胞開始，嘗試著檢測從Fluidigm公司平臺獲得的數據的質量情況，但它的有效性立即讓我們吃了一驚。”

 

Dr Zhiping Pang在編寫這篇文章及本報告中提到的流程時是斯坦福大學醫學院分子和細胞生理學系博士后。目前他是新澤西州兒童健康研究所和羅伯特·伍德·約翰遜醫學院的神經科學和細胞生物學系助理教授。他的工作重點是研究肥胖癥。

 

Dr Ami Citri博士是在斯坦福大學的精神病學和行為科學系做博士后的時候進的行這項研究。 2012年夏天，他將擔任耶路撒冷的希伯來大學的高級講師（助理教授）。他的工作重點是在成癮癥的研究。

 

Dr Citri 認為：“Fluidigm的方法效力非常巨大，我幾乎不會再回頭去使用傳統的定量PCR方法了。”

 

在他們的第一個實驗中，為了確定在人類多能干細胞中表達轉錄因子是否可誘導神經元的屬性，在未分化的人類胚胎干細胞（ES）中轉染了Brn2，ASCL1和myt1l（作者稱為“BAM”）與增強型綠色熒光蛋白（EGFP）。經過處理后，他們觀察到雙極類神經細胞及成熟的神經元形態，并表達典型的神經元細胞TUBB3和MAP2蛋白。電生理分析顯示，這些細胞產生了動作電位。因此BAM因素可在人類干細胞中誘導出神經細胞的的差異。在他們的第二個實驗中，他們想了解非神經元人成纖維細胞是否也可以被直接轉換成神經元。他們用BAM因素+ NEUROD1轉染初級人類胎兒成纖維細胞系（HFFs）。這些因素可產生成熟的神經元細胞，表達神經絲蛋白，及體現神經元的一些表征過程，包括具有synapsin and synaptotagmin（兩個突觸囊泡蛋白）染色陽性。因此，BAM+NEUROD1因素可誘導非神經元人成纖維細胞的神經細胞分化。

 

使用Fluidigm公司的48.48動態芯片進行單細胞基因表達分析。通過簇電極(patch electrodes)抽取收集生長在培養皿中的單細胞，并噴出到CellsDirect™緩沖液（Invitrogen）中，然后快速冷凍直到下一步工序。解凍的細胞進行特定目標的逆轉錄和18個循環的PCR進行預擴增（STA）。 預擴增產物在BioMark系統上進行實時PCR分析。為確保特異性的擴增，在每個實驗中包含梯度滴定的人腦總RNA，并只對表現出線性擴增的引物進行分析。此外，對單細胞和對照RNA的PCR產物熔解曲線進行比較，以確保PCR產物的特異性。BioMark系統為驗證免疫熒光和電生理的表型數據提供了另一層面的數據。這些研究人員在Nature protocols雜志上發布了他們的實驗路程：Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells。Dr Pang說：“當人們談論以傳統的方式做單細胞PCR時，我從來沒有留下深刻的印象。這是低通量的，他們不能運行驗證測試。但有了Fluidigm公司的技術，我們可以使有多個內部對照，我們可以確定一個實驗是否能工作。該系統給了我們完美的結果。真正讓我感到驚訝的是，當我們重復了其中一個芯片的實驗，我們得到幾乎相同的結果，所以它是高度可重復的。我們認為，在神經科學界的其他人可能有興趣做這方面的工作。因此，我們寫了這個操作流程的文章并被雜志接受。”

 

雖然這些研究人員主要使用的的BioMark系統進行神經元的研究，他們說，他們相信其他領域的研究也可以受益于這項技術。 “任何需要進行細胞群落在單細胞水平的多樣性的研究、及任何受起始原料限制的領域，這都將是富魯達技術發揮巨大效應的地方。”Citri博士說。“這可以是人的活組織切片檢查，或因為器官太小而從少量的組織中開始首次實驗，也可以是任何應用激光捕獲的顯微切割樣品，或提取的一個非常明確的細胞群體。”

 

Dr Pang說：“單細胞基因表達分析適用于許多領域，包括細胞生物學和神經學。當有異質性的細胞群，細胞特異性基因轉錄的識別就變得非常重要。”在這個研究之后，這兩個科學家已經接受了在各自新的研究機構的學術職位，但他們都打算繼續使用富魯達的平臺進行單細胞的研究。

 

“Fluidigm的方法效力是如此的巨大，我幾乎不會再回頭去使用傳統標準的定量PCR方法。”Dr. Citri說。“這是非常有用的，因為它讓我用高效率和低成本的方式驗證微芯片(microarray)數據。當我在各種應用中檢測大量的基因時，我不需要每次用微芯片來處理樣品。我可以用富魯達公司的微流體芯片用數百個探針研究很多樣本。從原始的微芯片實驗中我已經創建了一個候選基因和定量PCR探針數據庫。此外，有效地利用最小的樣品量，可以讓我把我的樣品作成一個文庫，每當一組新的基因成為我的興趣焦點時我可以不斷對他們進行檢測。對我來說，這是Fluidigm公司系統的巨大優勢之一。”

 

Dr Pang在2011年11月開始在新澤西州兒童健康研究所和羅伯特•伍德•約翰遜醫學院的神經科學和細胞生物學系擔任助理教授進行獨立科研工作。

 

“我實驗室的研究重點是：研究從干細胞到大腦的突觸調節機制。我有興趣了解肥胖人的食物攝入行為是如何被身體的激素和神經肽改變的。”他說， “一個有趣的現象是，在下丘腦區域有一組神經元表達瘦素（leptin）受體，但它們對瘦素的反應有很大差異。我推斷下丘腦不同的細胞有不同的基因表達模式，這些只能用單細胞基因表達譜來解析。我的另一個研究方向是用人的成纖維細胞或多能性干細胞誘導成神經細胞，用這作為細胞模型來研究人類神經系統疾病。單細胞的基因分析將是在我的實驗室中研究這些突觸調控會使用的主要技術之一。”

 

“任何需要進行細胞群落在單細胞水平的多樣性的研究、及任何受起始原料限制的領域，這都將是富魯達技術發揮巨大效應的地方。”

— Dr. Citri博士