引物設計重點因素及設計技巧
引物設計重點因素及設計技巧
想把引物合成的比較好，除了前引物和后引物的Tm不能相差太大，我們還要重點考慮以下因素：
一、GC含量
引物的GC含量一般為40-60%，以45-55%為宜，過高或過低都不利于引發反應。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，導致引物的GC含量不能在上述范圍內，這時應盡量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火溫度的選擇。如果G-C比例超出，則在引物的5’端增加As或Ts；而如果A-T比例過高，則同樣在5’端增加Gs或Cs。但也有認為：原來普遍認為PCR引物應當有50%的GC/AT比率的觀點其實是不對的，以人基因組DNA為模板，用81%AT的引物可以產生單一的、專一的、長250 bp，含有70% AT的產物。完全沒有必要復雜地去計算產物和引物的解鏈溫度，PCR引物的GC/AT比率應當等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。產物中GC含量最好大于引物中的GC含量。
二、Degeneracy 多義性
當設計多義引物時應盡量減少引物多義性，這樣會帶來更好的特異性，應盡量避免3末端的多義性，因為這里即使一個堿基的錯配都能阻止引物延伸。
三、3’ End Stability 3 末端穩定性
引物穩定性影響它的錯配效率，一條理想的引物應該有一個穩定性較強的5 末端和相對穩定性較弱的3 末端。如果引物3 穩定性強，有可能在即使5 末端不配對的情況下造成錯配，形成非特異性擴增條帶（secondary bands） 。而3 末端穩定性低的引物較好的原因是在引物發生錯配時，由于3 末端不太穩定引物結合不穩定而難以延伸。
四、GC Clamp GC鉗
引物與目的位點的有效結合需要有穩定的5 末端。這一段有較強穩定性的5 末端稱為GC鉗。它保證引物與模板的穩定結合。選擇有合適穩定性的引物能在確保不產生非特異性條帶的前提下盡量降低退火溫度。
五、Secondary Structures二級結構
二級結構是引物設計中必須考慮的一個重要因素。二級結構能顯著影響反應中能與模板正確結合的引物數量，發卡結構的存在能限制引物與目的位點的結合能力，從而降低擴增效率，形成發卡環的引物則不能在PCR擴增中發揮作用。
六、Hairpin發卡結構
發卡結構的形成是由于引物自身的互補堿基分子內配對造成引物折疊形成的二級結構，并由于發卡結構的形成是分子內的反應,僅僅需要三個連續堿基配對就可以形成。發卡結構的穩定性可以用自由能衡量。自由能大小取決于堿基配對釋放的能量以及折疊DNA形成發卡環所需要的能量，如果自由能值大于0 則該結構不穩定從而不會干擾反應，如果自由能值小于0 則該結構可以干擾反應。
七、Dimer 二聚體
引物之間的配對區域能形成引物二聚體，它是相同或不同的兩條引物之間形成的二級結構。它造成引物二聚體擴增并減少目的擴增產物，二聚體可以在序列相同的兩條引物或正反向引物之間形成，如果配對區域在3 末端問題會更為嚴重，3 末端配對很容易引起引物二聚體擴增。
八、False Priming 錯配
如果引物可以結合除目的位點外的其他區域，擴增效率將明顯降低目的產物帶將減少或出現涂布（smear）。3 末端連續幾個堿基配對形成錯配的傾向要高于引物上游區域同樣數量的堿基配對，在使用引物設計軟件時，您可以分別設定確認為錯配的3 末端或引物全長形成連續堿基配對的數量。
九、自由能問題（如何根據自由能判斷引物質量）
1、ΔG值(自由能)反映了引物與模板結合的強弱程度。一般情況下，引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀，即5’端和中間ΔG值較高，而3’端ΔG值相對較低，且不要超過9（ΔG值為負值，這里取絕對值），如此則有利于正確引發反應而可防止錯誤引發。3′末端雙鏈的ΔG是0～－2 kcal/mol時，PCR產量幾乎達到百分之百，隨著其絕對值的增加產量逐漸下降，在－6時只有40%、到－8時少于20%、而－10時接近于0。
2、引物二聚體及發夾結構的能量一般不要超過4.5，否則容易產生引物二聚體帶而且會降低引物濃度從而導致PCR 正常反應不能進行，與二聚體相關的一個參數是堿基的分布，3’端的連續GGG 或CCC 會導致錯誤引發。二聚體形成的能值越高越穩定，越不符合要求。與二聚體相同，發夾結構的能值越低越好。雖然有些帶有發夾環，其ΔG為－3 kcal/mol的自身互補引物也可以得到不錯的結果，但是如果它的3′末端被發夾環占據時就很麻煩，即會引發引物內部的延伸反應，減少了參與正式反應引物的數量。當然，如果發夾環在5′末端對反應就沒有多大的影響了。
十、產物需要測序的PCR引物的設計問題
在DNA測序的PCR中最好用5′末端穩定(如GC含量較多)，而3′末端不太穩定(如AT含量較多)的引物，這種引物的結構可以有效地消除假引發反應。這就是基于引物內部穩定性的經驗之談。其3′末端穩定性低的引物在這些反應中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的堿基與非靶位點堿基所形成的配對的穩定程度還不足以引發DNA合成，所以不會產生假產物。因此，為了有效地引發反應，引物的5′末端和中央部分必須與靶DNA也形成雙鏈。與此相反，帶有穩定的、GC豐富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都與靶序列配對，只憑借其3′末端與靶序列任何位點的牢固配合就可以引發反應，產生非專一產物。無論如何，寡核苷酸3′末端最后5個核苷酸的穩定性小于－9 kcal/mol的，通常就是專一性的探針或引物。寡核苷酸3′末端越不穩定，假引發的可能性越低。
順便說一下，如果新手剛開始接觸引物設計，推薦使用Primer Premier 5.0，因為它界面簡單，易學易用；如果你想把引物設計得盡善盡美，公認的首選軟件是Oligo，其次我認為是DNAstar。Oligo功能強大，所以使用起來就沒有Primer Premier 5.0那么簡便。先用Primer Premier 5.0設計，然后把設計好的引物拿到Oligo里去檢測這對引物的優劣，我想這對大多數引物設計者是一個不錯的選擇!
