孕酮（PRG）ELISA 試劑盒使用說(shuō)明

(德國(guó)DRG：EIA-1561)

1、前言

   孕酮是一種類固醇激素，含21個(gè)碳原子，在C-3上連有酮基，在C-4與在C-5之間為雙鍵連接。該類固醇激素是一種女性性激素，與雌激素共同在月經(jīng)周期中調(diào)節(jié)附屬的器官，它對(duì)于胚細(xì)胞著床前的子宮內(nèi)膜增生狀態(tài)和維持孕期是特別重要的。在非孕期婦女懷孕的胎盤成為主要來(lái)源。極少數(shù)來(lái)源于兩性的腎上腺皮質(zhì)。孕酮在循環(huán)血中主要與皮質(zhì)類固醇結(jié)合蛋白(CBG)，性激素結(jié)合蛋白(SHBG)和白蛋白結(jié)合，僅有循環(huán)總濃度的2-10%是游離激素。根據(jù)月經(jīng)循環(huán)周期血孕酮濃度范圍很寬，在卵泡期可以低于1ng/ml(3.2nmol/L)，在黃體期達(dá)到10-20ng/ml(32-64nmol/L)。在排卵后4-7天達(dá)到最高水平保持4-6天，在月經(jīng)開(kāi)始前24小時(shí)降至排卵前的水平，因?yàn)樵型�的升高和降低與卵巢卵泡和黃體的活動(dòng)相對(duì)應(yīng)，因此血漿孕酮的測(cè)定在臨床上常用來(lái)證明排卵和非孕婦女的黃體功能正常。假如排卵沒(méi)有發(fā)生，黃體則沒(méi)有生成進(jìn)而孕酮升高的循環(huán)也不能見(jiàn)到，異常的孕酮分泌與經(jīng)前期緊張子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)和黃體不全有關(guān)。孕酮濃度不僅個(gè)體之間有差異，而且同一個(gè)人每天甚至每個(gè)小時(shí)都會(huì)不同，一般的在婦科內(nèi)分泌紊亂或異常妊娠為了恰當(dāng)?shù)慕忉尣∫蜻B續(xù)測(cè)定比單個(gè)測(cè)定更有意義。在孕期孕酮更多的由胎盤產(chǎn)生，血漿水平在這個(gè)時(shí)期穩(wěn)定在200ng/ml的水平。

2、實(shí)驗(yàn)原理

   DRG公司的孕酮酶免試劑盒是一種基于競(jìng)爭(zhēng)法原理的固相酶免吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）。反應(yīng)板上的微檢測(cè)孔包被有能結(jié)合孕酮分子上獨(dú)特抗原位點(diǎn)的單克隆抗體。一份含有內(nèi)源性孕酮的病人樣本與辣根過(guò)氧酶標(biāo)記的孕酮競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合包被板上的抗體。溫育之后，未結(jié)合的酶聯(lián)物用洗滌液洗去。過(guò)氧酶與包被抗體的結(jié)合量與樣品中孕酮的濃度成反比。加入底物液后，所顯示的顏色強(qiáng)度與病人樣品中孕酮的濃度成反比。

3、試劑盒成分

1)       預(yù)包被反應(yīng)板    ，12條X8孔，96孔，微孔中包被了單克隆的抗孕酮抗體。

2)       標(biāo)準(zhǔn)品系列，7支，1ml，濃度：0；0.3；1.25；2.5；5；15；40ng/ml，轉(zhuǎn)換系數(shù)：1ng/ml=3.18nmol/ml，內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑，

3)       酶聯(lián)結(jié)物     ，1支，25ml，辣根過(guò)氧酶標(biāo)記的孕酮，內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑。

4)       底物液，1支，25ml，TMB

5)       終止液，1支，14ml，內(nèi)含0.5M的H₂SO₄

6)       濃縮洗滌液(40X)，1支，30ml.

注：用于樣品稀釋的零標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)視需要而定。

4、實(shí)驗(yàn)需要器材（但試劑盒不提供）

1)       酶標(biāo)儀(450±10nm)。

2)       移液器

3)       吸水紙

4)       蒸餾水

5、試劑貯存:

   未開(kāi)啟的試劑在2—8℃下貯存時(shí)，其活性在有效期內(nèi)穩(wěn)定，不要使用過(guò)期試劑。所有開(kāi)封了的試劑都必須儲(chǔ)存于2-8℃的環(huán)境下，微孔反應(yīng)板也必須貯存于2—8℃的環(huán)境下。一旦包裝袋被打開(kāi)，必須將它小心地嚴(yán)封起來(lái)。

6、試劑準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將所有的試劑和所需數(shù)目的板條都平衡至室溫。

洗滌液：在30ml的濃縮洗滌液中加入1170ml去離子水進(jìn)行稀釋，稀釋好的洗滌液室溫下可穩(wěn)定存放2周。

7、樣本采集和準(zhǔn)備

此實(shí)驗(yàn)中要使用到血清或血漿（EDTA-，肝素血漿），不要使用溶血、黃疸血或脂血樣品。請(qǐng)注意：含疊氮鈉的樣品不能用于此實(shí)驗(yàn)中。

7.1樣品的采集

血清：靜脈穿刺采集全血，待其凝血，在室溫下用離心機(jī)分離血清。未完全凝血前請(qǐng)勿離心，接受了抗凝劑治療的病人樣品可能需要更長(zhǎng)的凝血時(shí)間。

血漿：將全血收集到含抗凝劑的離心試管中，采集后立即離心。

7.2樣品的儲(chǔ)存

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，應(yīng)當(dāng)將樣品用蓋子蓋好，2-8℃環(huán)境下可穩(wěn)定存放24個(gè)小時(shí)。如果實(shí)驗(yàn)前想要將樣品存放更長(zhǎng)的時(shí)間，則應(yīng)將樣品凍存于-20℃的環(huán)境下。解凍的樣品在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)反復(fù)倒置幾次。

7.3樣品的稀釋

在首次實(shí)驗(yàn)時(shí)，如果血清樣品中睪酮的濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)品中睪酮的濃度，則應(yīng)將此樣品用零標(biāo)準(zhǔn)品稀釋10或100倍，并按實(shí)驗(yàn)步驟重新檢測(cè)。在計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)當(dāng)將此稀釋因子考慮進(jìn)去。

例如：

a）  按1：10的比例稀釋：10μl的血清+90μl零標(biāo)準(zhǔn)品（充分混合）

b）  按1：100的比例稀釋：10μl已稀釋好的a）+90μl零標(biāo)準(zhǔn)品（充分混合）

8、實(shí)驗(yàn)步驟：

1)       將所需數(shù)量的板條固定到板架上。

2)       將標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和已稀釋好的樣品分別用新的取樣吸頭取25μL加入到相應(yīng)的微孔中。

3)       室溫溫育5分鐘。

4)       在每一微孔中加入200μL酶聯(lián)物。

5)       充分混勻10秒，在這個(gè)步驟完全混勻很重要。

6)       室溫孵育60分種。

7)       快速棄去孔內(nèi)反應(yīng)物，每孔用400μL蒸餾水洗板3次，在吸水紙上拍干。注意：洗板步驟是否正確操作會(huì)明顯影響實(shí)驗(yàn)的靈敏度和精確度。

8)       在每一微孔中加入200μl底物液。

9)       室溫孵育15分種。

10)   加100μl終止液到每個(gè)檢測(cè)孔中終止酶反應(yīng)。

11)   加終止液后10分鐘之內(nèi)，用酶標(biāo)儀在450±10nm處測(cè)定OD 值。

9、結(jié)果計(jì)算

1)       計(jì)算每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和病人樣本的平均吸光度值。

2)       用吸光度值作為縱坐標(biāo)（y），濃度值作為橫坐標(biāo)（x），以每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值對(duì)其相應(yīng)的濃度值進(jìn)行標(biāo)繪，作一標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3)       用每一樣品的平均吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定其相應(yīng)的濃度。

4)       自動(dòng)計(jì)算方法：在IFU上，它用四參數(shù)曲線已自動(dòng)計(jì)算出結(jié)果。其它的歸納方法可能會(huì)得出稍微不同的結(jié)果。

5)       樣品的濃度可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取。樣品中孕酮濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)品的必須用進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋。在計(jì)算樣品濃度時(shí)就應(yīng)當(dāng)把此稀釋因子考慮進(jìn)去。

10、參考值

我們強(qiáng)烈建議各個(gè)實(shí)驗(yàn)市都建立自己的正常值和異常值。在一明顯正常人群的研究中，我們使用DRG公司的孕酮ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)得到如下結(jié)果：

           正常女性：

                 卵泡期         0.2 - 1.4ng/ml

                 黃體期          4 – 25ng/ml

                 絕經(jīng)期         0.1 – 1ng/ml

           正常男性：         0.1 – 1ng/ml