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本實驗采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗大鼠 NF-kB p65單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的 NF-kB p65與單抗結合，加入生物素化的抗大鼠NF-kB p65，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸，在450nm處測OD值，NF-kB p65濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中NF-kB p65濃度。

1.          收集標本：血清、血漿（EDTA）、細胞培養上清液、組織勻漿等盡早檢測，2-8℃保存48小時；更長時間須冷凍（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反復凍融。

2.          標準品液配制：使用前加入0.5ml蒸餾水混勻，配成20ng/ml的溶液。設標準管8管，第一管加標本稀釋液900ul，第二至第八管加入標本稀釋液500ul。在第一管中加入20ng/ml的標準品溶液100ul混勻后用加樣器吸出500ul，移至第二管。如此反復作對倍稀釋，從第七管中吸出500ul棄去。第八管為空白對照。

3.          10×標本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。

4.         洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）

             1.   將450ul標本稀釋液加入到一支1.5ml進口聚丙烯管中,再加10ul血清或血漿標本。

 2.   加20ul 1 N HCI,蓋緊，上下混勻。2－8℃放置60± 2分鐘。

     3.   加20ul 1 N NaOH,蓋緊，上下混勻。

     4.   即用，或放-20/-70℃保存3天。計算結果時乘以稀釋倍數50。（注意：不同的標本NF-kB p65的水平可能有較大差異，請根據實際情況靈活掌握稀釋度）

     5.   細胞培養上清或組織勻漿10倍稀釋(410ul的標本稀釋液＋50ul樣本＋20ul的1N HCI+20ul的1N NaOH)。

1.          加樣：每孔各加入標準品或待測樣品（已激活）100ul，將反應板充分混勻后置37℃120分鐘。

2.          洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。

3.          每孔中加入第一抗體工作液100ul。將反應板充分混勻后置37℃60分鐘。

4.          洗板：同前。

5.          每孔加酶標抗體工作液100ul。將反應板置37℃30分鐘。

6.          洗板：同前。

7.          每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應15分鐘。

8.          每孔加入100ul終止液混勻。

9.          30分鐘內用酶標儀在450nm處測吸光值。

1.          所有OD值都應減除空白值后再行計算。

2.          以標準品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0 pg/ml為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上作圖，畫出標準曲線。

3.          根據樣品OD值在該曲線圖上查出相應NF-kB p65含量，再乘上稀釋倍數即可。

             1.   靈敏度：最小的NF-kB p65檢測濃度小于15pg/ml。

2.        特異性：可同時檢測重組或天然的大鼠NF-kB p65。不與大鼠其它細胞因子有交叉反應。

3.        重復性：板內、板見變異系數均小于8.9％。

             1.   以上標準孔及待測樣品均建議做復孔，每次測定應同時做標準曲線。

 2.   洗滌過程很關鍵。洗滌不充分將導致精確度誤差及OD值錯誤地升高。

             3.   板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。

             4.   本試劑盒宜置4oC冰箱保存。

 5.   本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷！