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本實驗采用雙抗體夾心 ELISA法。用抗大鼠Insulin單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的 Insulin與單抗結合，加入酶標抗體，形成免疫復合物連接在板上，加入酶底物TMB，出現藍色，加終止液硫酸，顏色變黃，在450nm處測OD值，Insulin濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中Insulin濃度。

1.          收集標本：血清、血漿（EDTA、檸檬酸鹽、肝素抗凝）、細胞培養上清液、組織勻漿等盡早檢測，2-8℃保存48小時；更長時間須冷凍（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反復凍融。

2.          標準品第一次使用時用0.5ml的蒸餾水溶解，放置半小時混勻后使用，用后放在-20oC保存。溶解后濃度分別為14、8、3.2、1.6、0.8、0 ng/ml。

3.          標本如果需要稀釋可以用蒸餾水稀釋。

4.         洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）

1.          建立標準曲線：設標準孔6孔，每孔各加入標準品50ul。

2.          加樣：待測品孔每孔各加入待測樣品50ul。

3.          每孔加酶標抗體工作液50ul。將反應板置37℃120分鐘。(室溫過夜可以提高靈敏度)

4.          洗板：同前。

5.          每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應15分鐘。

6.          每孔加入100ul終止液混勻。

7.          30分鐘內用酶標儀在450nm處測吸光值。

1.          所有OD值都應減除空白值后再行計算。

2.          以標準品14、8、3.2、1.6、0.8、0ng/ml為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上作圖，畫出標準曲線。

3.          根據樣品OD值在該曲線圖上查出相應Insulin含量。

             1.   靈敏度：最小的Insulin 檢測濃度小于0.4ng/ml。

2.        特異性：可同時檢測重組或天然的大鼠Insulin。不與大鼠其它細胞因子有交叉反應。

3.        重復性：板內、板見變異系數均小于10％。

             1.   以上標準孔及待測樣品均建議做復孔，每次測定應同時做標準曲線。

 2.   洗滌過程很關鍵。洗滌不充分將導致精確度誤差及OD值錯誤地升高。

             3.   板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。

             4.   本試劑盒宜置4oC冰箱保存。

 5.   本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷！