方法 |
原理 |
優點 |
缺點 |
電泳 |
水溶性的蛋白根據電場的原理從負極向正級移動,移動的速率取決與其電荷、大小和形狀。 |
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蛋白被識別之前凝膠劑肯定被染色,凝膠劑染色本身沒有用處,如果沒有另一種檢測技術的使用,諸如免疫印跡或者質譜分析技術,蛋白不能被精確地鑒別。 |
SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳
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蛋白質移行通過惰性聚丙烯酰胺凝膠,孔徑大小的可調節性可阻止蛋白,SDS是負電荷的洗滌劑,它可以展開蛋白質的分子鏈,成為游離的分子,蛋白質以不同的速率向正極移行。 |
分離所有類型的蛋白質,甚至那些非水溶性的蛋白質。 |
一維分離方法分離是有限的。接近傾向重疊,僅能解決小分子量的蛋白質。 |
二維凝膠電泳
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第 1 相電泳是根據蛋白質的等電點不同在p H 梯度膠中進行等電聚焦電泳。第 2 相電泳根據蛋白質等電聚焦的原理,根據蛋白質分子量的大小在凝 膠 電 泳 ( SDS-PAGE)進行蛋白質分離 。 |
同多種蛋白凝膠電泳相比,這種方法分離混合物分辨率高,根據圖像分析比較便利,蛋白質分解的大約每毫升1ng。 |
高豐度蛋白存在可能是模糊的(例如白蛋白、免疫球蛋白)低豐度蛋白的分離蛋白質需要從凝膠中移除斑點,消化,利用質譜分析法分析肽,它不能分辨小分子重的蛋白質(<10,000 Da)。不能順從多變的分析。 |
二維熒光差異凝膠電泳
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二維電泳使用不同的青藍燃料從不同的樣品中標記蛋白,在不同的光的波長發生酶倍增免疫測定技術,混合樣品中達到三種的樣品能夠被標記(測試、對照、參考) |
從混合物中分析不同的蛋白質這種方法很簡單,在單一的凝膠中可以得到蛋白質表達的速率,在每一個凝膠或者是不同凝膠之間變化的復位由一個內部的標準,非常敏感。 |
高豐度蛋白存在可能是模糊的(例如白蛋白、免疫球蛋白)低豐度蛋白分離蛋白質最終需要從凝膠中移除斑點,消化,利用質譜分析法分析肽,許多斑點不能辨別,因為材料的缺乏,它不能分辨小分子重的蛋白質(<10,000 Da)。 |
蛋白質芯片多種蛋白質的芯片、細胞因子芯片、組織微數列 |
已知的蛋白質局限到一個表面(念珠、硝酸纖維素),利用免疫測定的原理檢測。 |
高敏感率和處理量,多種分析物可以同時測定。 |
有限抗體的有效性和特異性需要一些先前蛋白質表達的知識。可能不能檢測分析亞型。 |
基質輔助的激光解吸離子化-飛行時間-質譜技術
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決定蛋白質或者肽片段的精確積聚。蛋白質或肽片段是由有機酸間質混合而成的,在金屬載玻片上干燥,激光離子化破壞肽類片段, 這可以使得在電場中向檢測器方向移動。到達檢測器的時間取決于電荷和形狀。通過質譜分析技術可以獲得肽類的遺傳信息。 |
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最大的測定分子量<3000Da |
蛋白質芯片表面增強激光解析電離-飛行時間-質譜技術
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與基質輔助的激光解吸離子化-飛行時間-質譜技術比較,不同點在于它使用了色譜技術,從復雜試樣中,有選擇的結合蛋白質亞型。
沖洗移去表面非特異性凝結蛋白質和其他物質,這些物質可以干擾離子化的進程。(鹽,去污劑等) |
高流通量病毒免疫測定自動化;樣本量最小;初步分離原材料可以增強低豐度蛋白的檢出率。
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不能直接辨別蛋白質。對高分子量蛋白質(分子量>20 kDa)不敏感。 |
穩定同位素標記
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生物樣本使用不同的穩定同位素,這些同位素使用變調劑靶向于一種特異性的氨基酸。介于分離和質譜分析法之后,兩個不同樣本的肽在不同質量單位的特異同位素中使用,能獲得相對量化。 |
蛋白組學比其他方法普及。在大量的蛋白質中能獲得度量信息。通常能獲得相關蛋白的識別數據信號。 |
高技術要求,低處理能力。樣本在檢驗前需經過胰蛋白酶處理。這種可靠的方法適合于檢測大量蛋白質。 |