高分辨率熔點分析技術進行凍存組織樣本甲基化的檢測
羅氏癌癥研究應用：高分辨率熔點分析技術進行凍存組織樣本甲基化的檢測
1 前言
啟動子高度甲基化是惡性腫瘤基因轉錄中的一種很常見的現象，被視為細胞惡性轉化的標志之一。DNA甲基化分析是一種基因檢測工具，用于早期癌癥檢測、風險評估與治療療效評估，具有非常誘人的前景。
DNA甲基化檢測最常用的方法主要依賴于亞硫酸氫鈉對基因組 DNA 的處理，將胞嘧啶轉換成尿嘧啶，未修飾5-甲基胞嘧啶。經過修飾的基因序列發生改變，可對后續的 PCR 擴增產物中的甲基化胞嘧啶進行鑒別。
通過亞硫酸測序分析，可對基因甲基化情況進行最準確的評估，可鑒定單甲基化胞嘧啶。并開發出了幾種更加簡單的以 PCR為基礎的方法，這些方法對于小規模的研究性實驗室來說，非常重要。這些方法較新、較簡單、容易操作。高分辨率熔點分析方法（HRM）即是這幾種方法之一。HRM 是基于溶液中 DNA 的“熔解”特性。該方法的原理是，通過基于不同熔解溫度的熔點分析，區分出具有不同甲基化胞嘧啶含量的雙硫酸處理的 DNA 模板。由于不需要昂貴的探針與內參基因進行標準化處理，HRM 是一種相對簡單，而成本又較低的方法。通過 HRM 技術的應用，可對擴增子內所有 CpGs 進行分析，根據熔解曲線的形狀，可對同源性及異源性甲基化進行區分。這一點非常重要，因為啟動子 CpG 島的甲基化模式通常為非同源性。
對于生物標志物檢測來說，凍存組織是一種非常重要的資源。于福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）組織上，對主要分析方法的性能進行了檢測。當前研究的目的，是對結直腸癌個體凍存 FFPE 組織上啟動子甲基化檢測 HRM 分析進行評價及確證。
2 材料與方法
2.1 對照與研究樣本
將CpGenome通用甲基化DNA（Chemicon/Millipore,Billerica, MA）與來自外周血單個核細胞（PBMNCs）DNA 作為甲基化與非甲基化對照。于非甲基化 PBMC DNA 中對甲基化對照 DNA 進行稀釋處理，生成甲基化標準品（50%、25%、10%、5%、1% 與 0.1%）。HRM 檢測優化后，我們對來自于結直腸腫瘤個體的凍存組織樣本進行了分析。
2.2 DNA提取與雙硫酸修飾
對來自于培養腫瘤細胞系的健康志愿者PBMNC DNA與DNA 進行分離。對于來自于凍存研究組織的DNA分離物來說，使用的是來自于FFPE 腫瘤組織塊的10 μm 厚度的切片。
2.3 MethyLight 檢測
有關MGMT與APC MethyLight檢測說明，見前期文獻描述。簡言之，于LightCycler® 480儀器上進行PCR。
2.4 高分辨率熔點分析
于LightCycler® 480儀器（羅氏）上進行PCR擴增與HRM。考慮到FFPE DNA呈高度片段化，大的擴增子會導致熔點分辨率降低，擴增子被設計為不超出200bp。
使用Gene Scanning與TM Calling軟件模塊（羅氏）進行HRM數據分析。通過對代表著PCR產物熔解前及熔解后兩個標準化區域的計算，對熔解曲線進行標準化處理。通過這種計算，可對具有不同起始熒光強度的樣本進行直接比較。標準化溫度轉換熔解曲線圖顯示，隨著溫度升高， 熒光強度降低。
3 結果與討論
對標準稀釋品進行檢測，測定HRM檢測的靈敏性。通過所有HRM檢測（APC、MGMT、GSPT1和PTEN），我們可以在保證重現性的基礎上，于非甲基化DNA背景中，檢測到1% 的甲基化的DNA（圖1A-D）。
圖 1：MGMT（A）、APC（B）、GSTP1（C）與 PTEN（D）甲基化 HRM檢測靈敏性。
以三種方式顯示甲基化標準曲線。100 % 甲基化顯示為紅色、50 % 甲基化顯示為橙色、25 % 甲基化顯示為綠色、10 % 甲基化顯示為藍綠色、1% 甲基化顯示為黃色、0.1% 甲基化顯示為紫色，0 % 甲基化顯示為藍色。
下一步，我們對福爾馬林固定、是蠟包埋處理對啟動子高度甲基化檢測的作用進行了評價。我們能夠對 APC啟動子高度甲基化進行檢測，檢測可靠性較高。圖2（A–C）顯示，新鮮與FFPE細胞系DNA APC HRM檢測重現性與一致性較近似。
圖 2：使用來自于不同腫瘤細胞系--甲基化標準品（黑色曲線、100 %、50 %、25 %、10 %、1%、0.1%、0 %）與樣本（彩色曲線）均呈三重顯示。甲基化標準品（黑色曲線、100 %、50 %、25 %、10 %、1%、0.1%、0 %）與樣本（彩色曲線）均呈三重顯示。（C）來自于 8 份乳腺癌與前列腺癌細胞系的新鮮與 FFPE 腫瘤細胞系 DNA APC HRM 檢測的批間變異性。條形圖代表6個獨立性實驗的平均值及標準差。
FFPE組織啟動子HRM甲基化分析具有以下潛在應用前景。對具有淋巴結及遠處轉移的原發腫瘤甲基化的確定，不僅可闡明疾病進展過程中發生的表觀遺傳學事件，而且可輔助確定石蠟包埋組織樣本的預測性標志物。
4 結論
我們的研究進一步證實了FFPE組織啟動子甲基化分析定量HRM的適用性。FFPE組織是正常對照與病變組織最大的樣本材料來源，這些組織的應用，對于研究來說具有不可估量的價值。方法學評價對于實驗穩定性的確證非常重要，可輔助確立該檢測方法是否適合作為一種研究工具以及可能的常規檢測手段。
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