牛體內(nèi)重組牛生長激素 (rbST) 快速高靈敏度檢測

Gaud Pinel1 ， Sandrine Roulet-Rochereau1 ， Marie-Hélène Le Breton1,2 ，
Sylvain Chéreau1 ， Fabrice Monteau1 ， Paul Silcock3 ，與 Bruno Le Bizec1
1 Laboratoire d’ Etude des Résidus et Contaminants dans les Aliments (LABERCA) ， ONIRIS ， Nantes ， France 法國 LABERCA 化學(xué)實(shí)驗(yàn)室
2 瑞士洛桑雀巢公司，雀巢研究中心
3 英國曼徹斯特沃特世公司

應(yīng)用優(yōu)勢

牛注射了重組牛生長激素，過幾天后檢測藥物在牛體內(nèi)的殘留。首次得到了明確的檢測結(jié)果，可用于此類藥物的使用監(jiān)控。

■ Xevo TQ MS 的高靈敏度可準(zhǔn)確檢測生物基質(zhì)中的重組牛生長激素（ rbST ），符合 2002/657/EC 要求。
■ 方法的靈敏度高，非常適合用于在給藥幾天后檢測動(dòng)物血液中痕量的殘留激素藥物。
■ Xevo TQ MS 提供重復(fù)性好的結(jié)果，且基質(zhì)效應(yīng)很低，這對(duì)于藥物監(jiān)控計(jì)劃實(shí)施中的常規(guī)分析來說是十分重要的。

沃特世解決方案

■ ACQUITY UPLC ， Xevo TQ MS

關(guān)鍵詞

■ rbST ， reST ，生長激素，食品安全

簡介

動(dòng)物性食品安全控制是政府、國際法規(guī)機(jī)構(gòu)與組織的重要任務(wù)，應(yīng)該在食品進(jìn)入消費(fèi)環(huán)節(jié)之前就對(duì)食品安全進(jìn)行有效的檢測和控制。因?yàn)樯鲜泻蟮氖称钒踩�事件可能影響消費(fèi)者信心與國際貿(mào)易。

重組牛生長激素（ rbST ），又稱為生長激素，在一些國家通常作為豬或牛的生長促進(jìn)劑，將其用于乳牛可以增加牛奶產(chǎn)量 1,2 。然而，生長激素的使用有嚴(yán)格的法律規(guī)范，在歐盟國家是完全禁用的 3,4 。但是，這項(xiàng)法規(guī)的執(zhí)行面臨著很大的困難，主要是因?yàn)槿狈τ行У姆治龉ぞ邅頇z測是否存在濫用該激素的情況。此分析的困難在于生長激素本身是蛋白質(zhì)，且在生物基質(zhì)中濃度較低，而樣品基質(zhì)組成又十分復(fù)雜。至今為止，分析方法僅僅局限為酶聯(lián)免疫檢測，這個(gè)方法不能將天然存在的激素與重組激素分離開來；盡管也有其它應(yīng)用報(bào)導(dǎo)，但都不能專屬性很強(qiáng)地檢測生理水平的重組牛生長激素（ rbST ） 5,6 。

直到最近才開發(fā)出了一項(xiàng)直接檢測生物基質(zhì)中重組牛生長激素（ rbST ）的方法 7,8 ，這個(gè)方法是將重組生長激素用胰蛋白酶進(jìn)行水解，然后分析生長激素專有的 N- 端肽鏈。事實(shí)上，天然激素的 N- 端氨基酸是丙氨酸，而重組激素的 N- 端氨基酸是甲硫氨酸。

此應(yīng)用文章展示了使用 Waters® XevoTM TQ MS 分析注射了重組激素的動(dòng)物血漿樣品中的藥物。在注射后幾天進(jìn)行檢測，可清晰檢測出結(jié)果，展示了一流水平。

實(shí)驗(yàn)部分

重組激素標(biāo)準(zhǔn)品

重組牛生長激素（ rbST ）標(biāo)準(zhǔn)品與重組馬生長激素（ reST ）分別購自哈勃 UCLA 醫(yī)學(xué)中心國家激素與垂體項(xiàng)目（美國托蘭斯）以及 Bresagen 有限公司（澳大利亞 T hebarton ）。

樣本制備

重組牛生長激素在血漿中的樣本提取、純化步驟依照文獻(xiàn)進(jìn)行。 7,8

MS 條件

MS 系統(tǒng)： XEVO TQ MS
離子化模式： ESI+
毛細(xì)管電壓： 3 kV
源溫度： 150 ℃
脫溶劑溫度： 550 ℃
脫溶劑氣速： 800 L / 小時(shí)
碰撞氣流速： 0.15 mL/ 分

MRM 方法參數(shù)

MRM 通道通過 Masslynx 軟件中的 IntelliStartTM 行獨(dú)立的參數(shù)優(yōu)化，詳見表 2 。

結(jié)果與討論

LC/MS/MS 條件優(yōu)化

ACQUITY UPLC 系統(tǒng)對(duì)胰蛋白酶水解的 N- 端肽片段又很好的保留和分離效果，總運(yùn)行時(shí)間 8 分鐘，重組牛生長激素（ rbST ）與重組馬生長激素（ reST ）的 N- 端保留時(shí)間分別為 2.74 和 2.79 分鐘（圖 1 ）。

重組牛生長激素（ rbST ） N- 端肽鏈在電噴霧正離子模式產(chǎn)生雙電荷的離子 [M+2H]2+=913 ，將此離子作為母離子。根據(jù) 2002/657/EC 歐盟委員會(huì)決議 10 ， MRM 方法中選擇了兩個(gè)子離子用于確證；重組馬生長激素（ reST ）作內(nèi)標(biāo)物，在樣品中的濃度為 100 ng/mL ，其 N- 端肽鏈在電噴霧正離子模式產(chǎn)生三價(jià)電荷的離子 [M+3H]3+= 623 ，將其作為母離子。

動(dòng)物注射生長激素后體內(nèi) rbST 的檢測

此方法用于檢測注射生長激素后的動(dòng)物樣品。對(duì)奶牛一次性皮下注射 500mg Lactatropin® 藥物，然后取樣分析。

圖 1 對(duì) 10 ng/mL 的 rbST 和 reST 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣， UPLC(ESI+)/MS/MS 的 MRM 特征離子信號(hào)分別為 rbST 的 N- 端碎片離子為 913>774 和 913>1047 ； reST 的 N- 端碎片離子為 623 >795 和 623 >530

圖 2 使用 UPLC （ ESI+ ） /MS/MS 分析注射藥物前（ D0 ）與注射后兩天（ D2 ）采集到的血漿樣本的的 MRM 特征離子信號(hào)圖譜

圖 2 顯示了注射藥物前采集到的血漿樣本得到的譜圖（ D0 ）以及注射藥物兩天后血漿樣本的譜圖（ D2 ）。

圖 2 的結(jié)果表明：可以在給動(dòng)物注射生長激素兩天后在奶牛的血漿中檢測到 rbST 。對(duì)采集到的特征信號(hào)分析表明此方法可以對(duì)生長激素這個(gè)蛋白進(jìn)行明確的確證，符合 2002/657/EC 的要求，同時(shí)確認(rèn)了檢測方法的靈敏度。

與預(yù)計(jì)的動(dòng)物血漿蛋白水平一致。基質(zhì)干擾幾乎檢測不到，在實(shí)際血漿樣本中的良好線性可保證對(duì) rbST 的進(jìn)一步相對(duì)定量結(jié)果，在注射生長激素兩天后還可以檢測到血漿中 50 ppb 的藥物，與以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致 7,11 。表 3 顯示了平行進(jìn)樣 10 次得到的分析結(jié)果，這充分說明 Xevo TQ MS 在檢測低含量復(fù)雜樣品時(shí)能夠提供重復(fù)性好的數(shù)據(jù)。

結(jié)論

■ Xevo TQ MS 的高靈敏度可準(zhǔn)確檢測生物基質(zhì)中的重組牛生長激素（ rbST ），符合 2002/657/EC 要求
■ 方法的靈敏度高，非常適合用于在給藥幾天后檢測動(dòng)物血液中痕量的殘留激素藥物
■ Xevo TQ MS 提供重復(fù)性好的結(jié)果，且基質(zhì)效應(yīng)很低，這對(duì)于藥物監(jiān)控計(jì)劃實(shí)施中的常規(guī)分析來說是十分重要的

參考文獻(xiàn)

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