原代細胞DNA與RNA的吖啶橙熒光染色法
原代細胞DNA與RNA的吖啶橙熒光染色法
基本原理：
吖啶橙（acridine orange，AO）是一種常用熒光染料，吖啶橙與原代細胞內(nèi)的DNA、RNA都有親和力，但有一定的特異性，即結合后發(fā)不同顏色的熒光，DNA呈亮綠色，而RNA呈橘紅色至火紅色。此法簡便快捷，既可染活原代細胞又可染固定原代細胞。用于直接染色觀察活原代細胞或固定染色觀察原代細胞均可。吖啶橙對活原代細胞毒性小，配成1×10-4—2×10-4可用于直接染色活原代細胞和進行熒光顯微鏡觀察，但不持久，用固定染色觀察法效果更好。
材料：
1. 蓋片單層培養(yǎng)原代細胞；
2. 固定劑：95%乙醇或乙酸/甲醇（現(xiàn)配）；
3. 吖啶橙：用生理鹽水配成1%的干液。使用時再用PBS稀釋成1×10-4—2×10-4mol/L pH4.5—5.0的染色液；
4. 0.1mol/L的CaCl2；
5. 1%乙酸；
染色步驟：
1. 將蓋片單層培養(yǎng)原代細胞從瓶中取出，立即用溫Hanks液漂洗3—5s，以去除培養(yǎng)基中血清；
2. 投入95%乙醇或乙酸/甲醇固定15—30min，用濾紙接觸蓋片邊緣，蓋片微干；
3. 用1%乙酸酸化30s；
4. 用1×10-4—2×10-4的吖啶橙染液染色30s或1min；
5. 用0.1mol/L的CaCl2處理30s—2min；
6. PBS漂洗3次，每次數(shù)秒；
7. PBS封片，熒光顯微鏡下直接觀察并拍照；
8. 注意事項：觀察中應隨時填加PBS以避免標本干涸。如用油浸鏡觀察，需再覆以大蓋片蓋在附有原代細胞蓋片上，保證原代細胞面朝上，用無熒光性油浸鏡觀察。原代細胞蓋片標本在95%乙醇中能保存數(shù)日后仍可觀察，如退色，再用AO染色。鏡下觀察，DNA呈翠綠色，RNA呈火紅色。
結果：
原代細胞核因含DNA呈綠色，細胞質(zhì)及核仁因含RNA呈紅色；
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