Ying Qing Yu 與 Martin Gilar  / 美國馬薩諸塞州米爾福德沃特世公司

簡介

本應用紀要中，我們介紹了沃特世專利 RapiGest™ SF 試劑的物理化學性質及其應用領域。 2002 年，我們首次推出 RapiGest SF ，這一創新產品是幫助酶消解的有利工具，可促進溶液中蛋白的消解，它能夠改善樣品制備過程中蛋白的溶解度。

RapiGest SF 提高酶解速率與完全程度的機理詳見圖 1 。溫和的蛋白變性可打開蛋白結構并暴露酶切位點，以供酶切。在 RapiGest SF 溶液中，酶對變性的耐受性優于普通蛋白，并能保持活性。在加入酶之前高溫加熱 RapiGest SF 溶液可使球蛋白更為完全變性，之后需將酶與樣品一起進行 37 °C 的孵育。 1,2

超過 200 多家行業內雜志引用了使用 RapiGest SF 進行樣品溶解的案例，大部分為蛋白組學的應用。最近，許多制藥實驗室使用 RapiGest SF 用于蛋白藥物的確證。因為酶消化的速度的提高并在 LC 、 MS 分析前極易清除， RapiGest SF 已被多個應用領域廣泛接受，其中包括高級序列研究的 LC/UV/MS 蛋白藥物的肽圖分析。

討論

什么是 RapiGest SF?

RapiGest SF 是酸性不穩定表面活性劑，在酸性條件下極易水解。 1 這種獨特的性質，在需要的時候，可用于從溶液中清除表面活性劑。 RapiGest SF 的結構及其水解副產物見圖 2 。酸性不穩定的性質可在 pH2 條件下， 45 分鐘內達到完全降解。 1

該表面活性劑可降解為兩個產物： dodeca-2-one 和 3- （ 2,3- 二羥基丙基）丙磺酸鈉。前者與水不能互溶，可通過離心清除。后者在水溶液中溶解度很高，而在反相 LC 模式下不保留。酶消解后的水溶液可直接進行 HPLC 、 LC/MS 或 MALDI-TOF MS 進行分析。

消解后的清除

樣品分析前無需額外去清除表面活性劑（如透析）。在分析前，酶消解后通常經過酸（如甲酸、三氟乙酸（ TFA ）或鹽酸（ HCl ））的酸化，降解 RapiGest SF 。建議降解條件 pH ≤ 2 。

胰蛋白酶消解的兼容性

胰蛋白酶是最常見的蛋白水解酶，可用于肽圖分析和蛋白組學的應用。我們研究了在添加 RapiGest SF 的情況下胰蛋白酶的活性作用，并與文獻中最常見的變性劑的作用做了對比。本檢測基于胰蛋白酶誘導 N-α- 苯甲酰 -L- 精氨酸乙基乙酯（ BAEE ）在 50 mM 重碳酸胺（ pH 7.9 ）中的室溫水解。胰蛋白酶活性的變化通過 UV 253 nm 下測量 BAEE 水解率進行計算。在選擇的變性溶液中，胰蛋白酶活性與對照樣品進行對比（非變性劑）。結果見于表 1 。

表 1 中的數據說明低濃度下（ 0.1% ） RapiGest SF 不抑制胰蛋白酶的活性。這與結構上類似的表面活性劑 SDS 不同， SDS 是很強的變性劑，可會使胰蛋白酶失活。尿素、乙腈或鹽酸胍也是胰蛋白酶消化的變性劑。但是乙腈是強洗脫劑會干擾消解樣品進行反相 LC 分析。正如我們所知，尿素可使蛋白共價修飾，鹽酸胍也和 SDS 一樣可以使酶失活。

本實驗說明蛋白酶的活性受到蛋白溶液中所用變性劑的影響。 RapiGest SF 在從低到高的濃度下均不改變酶活性，因此，最佳的蛋白消解條件是無需過量酶即可達到酶解的結果。

快速蛋白消解

對蛋白酶解存在抗性的蛋白使用 RapiGest SF 試劑，可在數分鐘內消解完全。完全消解球蛋白、馬肌紅蛋白只需要 5 分鐘內即可完成。該試劑輔助的消解結果與對照見圖 3 。由于肌紅蛋白是 球蛋白 ，眾所周知，若沒有表面活性劑將難以消解。在對照反應中，與胰蛋白酶孵育 9 小時后只有少量的蛋白可以消化。使用了 RapiGest SF 試劑，總體的消解的效率顯著提升。

在蛋白藥物肽圖中的序列覆蓋范圍更大

RapiGest SF 在蛋白組學的樣品前處理中廣泛使用，是有效的蛋白溶解變性劑。最近越來越多的生物制藥實驗室在肽圖分析中采用了 RapiGest SF 。一些發表的論文記錄了使用 RapiGest SF 進行蛋白藥物消解的優勢。 4,5 經報導的 RapiGest SF 濃度范圍為 0.05 -1% ，取決于蛋白疏水性與濃度。

我們發現濃度范圍為 0.05 -1% 的 RapiGest SF 足以使各種大小的蛋白變性，高濃度 RapiGest SF 適合全細胞蛋白提取的實驗。

單抗（ mAbs ）肽圖分析一直以來都因為難以消解這些大疏水蛋白而難以實現。肽圖分析的目的是確認蛋白序列并發現所有存在后翻譯修飾（ PTMs ）的蛋白。圖 4 舉例說明了 RapiGest SF 輔助的人單抗消解的實例。樣品制備與分析的參數以 UPLC ® 和四級桿 Tof 質譜分析的參數已列表作為指導。

人化單抗 IgG 多肽圖譜

蛋白序列覆蓋率 = 98%

圖 4 顯示實驗中總序列覆蓋率為 98% 。數據分析通過 BiopharmaLynx™ v.1.2 軟件得到。高序列覆蓋率（ 98% ）說明單抗完全消解。 LC/MS 分析中沒有發現錯誤酶切的多肽或完整未被酶切的蛋白。剩下的 2% 未確認的序列為少數二個氨基酸的肽或單個氨基酸（ R 或 K ），而無法在反相柱上保留。

樣品制備

人單抗樣品（ 10 μL, 21 mg/mL ）在含有 0.1% （ w/v ） RapiGest SF 的 50 μL 50 mM 重碳酸銨中溶解。將 2 μL 0.1 M 的二流蘇糖醇（ DTT ）加入樣品，樣品在 50 °C 加熱 30 分鐘，加入 4 μL 0.1 M 的碘代乙酰胺，在樣品冷卻至室溫后樣品在黑暗中靜至 40 分鐘。

樣品中加入 8 μg 胰蛋白酶（胰蛋白酶濃度 = 1 μg/μL ），樣品在 37 °C 孵育過夜。消解樣品與 1% 甲酸與 10% 乙腈混合（ 1 ： 1 ， v ： v ）。用 Milli-Q 水（ Millipore ）稀釋至 5 pmol/μL 后進行 LC/MS 分析。

LC 條件

LC 系統： 沃特世 ACQUITY UPLC ® 系統
色譜柱： ACQUITY UPLC BEH 300 C 18 肽分離專用柱 , 2.1 x 100mm （ P/N = 186003686 ）
柱溫： 40 °C
樣品進樣： 2 μL （ 10 pmol ）
溶液 A ： 0.1% 甲酸水溶液
溶液 B ： 0.1% 甲酸乙腈溶液
流速： 200 μL/min
梯度： 0-2 分鐘 :2%B
2 – 92 分鐘： 2 -35% B
92 -102 分鐘： 35 - 50% B
102.1 -105 分鐘 ： 90% B
105.1-110 分鐘： 2% B

MS 條件

MS 系統： 沃特世 SYNAPT™ MS （ V 型）
毛細管電壓： 3.2 kV
源溫度 . ： 120 °C
去溶劑溫度 . ： 350 °C
去溶劑氣： 700 L /hr
MS 掃描速率： 1 秒 / 次

鎖定質量通道 ： 100 fmol/μL Glu-Fib 多肽（ m/z 785.8426, z = 2 ），流速 20 μL/min

與其他的蛋白酶合用

我們測試了 RapiGest SF 與多種蛋白酶的適配性，如 Asp-N, Lys-C 與 Glu-C 。在酶解前使用 RapiGest SF 變性蛋白獲得了有效的消解結果。

蛋白去糖基化的用途

RapiGest SF 也用于測試其它酶，如 PNGase F ，該酶用于酶切糖蛋白 N- 連接的糖基。 2 圖 6 說明了去糖基化雞蛋卵清蛋白。在 RapiGest SF 介質中 PNGase F 消解 2 小時后觀察到了完全的去糖基化反應。

結論

•  RapiGest SF 促進了蛋白酶解的速度與完全程度，能夠得到蛋白藥物序列覆蓋率很高的肽圖分析。

•  RapiGest SF 是適用于蛋白組學、糖蛋白與生物制藥應用的領域

•  幾乎無需消解后樣品處理，簡單樣品酸化，足以從溶液中去除 RapiGest SF 。多種情況下 LC/MS 分析前只需簡單稀釋。

•  RapiGest SF 簡化了樣品制備方法，可提高分析通量；使用該方法提高實驗室工作效率并提高數據質量。

參考文獻

1. Yu YQ, Gilar M, Lee PJ, Bouvier ES, Gebler JC. Enzyme-friendly, mass spectrom- etry-compatible surfactant for in-solution enzymatic digestion of proteins. Anal.

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