正常人骨膜內(nèi)成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)材料：

1. 骨組織來源：手術(shù)切除之骨組織；

2. 清洗液：不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，pH7.2；

3. 消化液：0.25%胰蛋白酶溶液，1mg/mlⅠ型膠原酶溶液；

4. 培養(yǎng)液：RPMI 1640培養(yǎng)基，配制培養(yǎng)液時(shí)加入15%的小牛血清，并用5.6% NaHCO3調(diào)節(jié)至pH 7.2；

實(shí)驗(yàn)方法：

1. 取人手術(shù)切除之骨膜，放入盛有緩沖液的培養(yǎng)皿中，去除附于骨膜上的結(jié)締組織；

2. 將骨膜剪碎成1—2mm2大小的組織塊（膜片）；

3. 加入0.1%EDTA與0.25%胰蛋白酶（1：1，V/V）混合消化液，在37℃下消化20—30min。以1000r/min離心1—2min，沉淀骨膜組織塊，除去上清液；

4. 用緩沖液洗沉淀骨膜組織塊2—3次，重復(fù)上述離心過程；

5. 在37℃下再用1mg/mlⅠ型膠原酶消化骨膜組織塊約90min。離心（1000r/min，5—10min）以沉淀細(xì)胞，棄去消化液。再用培養(yǎng)液洗1—2次，離心收集細(xì)胞；

6. 加培養(yǎng)液于離心管中分散細(xì)胞，調(diào)成細(xì)胞密度1×106—5×106個(gè)/ml的懸液。將細(xì)胞懸液種植于培養(yǎng)瓶中。也可不使用消化酶而行植塊培養(yǎng)法種植培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同前；

7. 待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶壁后進(jìn)行傳代培養(yǎng)；