零殘留活性劑、零絮凝納米球在免疫檢測試劑中的應用
國家生化工程技術中心(北京)
1.現代免疫檢測的工作原理
免疫檢測是目前醫療衛生和生物科學研究領域常用的診斷方法。免疫檢測的核心步驟為抗原-抗體間特異性的復合反應，通過復合反應產生檢測信號，實現對溶液中抗體或抗原性的定量。由于抗體分子能夠識別非常有限的分子種類，因此免疫檢測能夠獲得極高的準確性。
酶標抗體技術是通過共價鍵將酶連接在抗體上，制成酶標抗體，再借酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，于普通顯微鏡或電鏡下進行細胞表面及細胞內各種抗原成分的定位，根據酶標記的部位可將其分為直接法（一步法）、間接法（二步法）、橋聯法（多步法）等，用于標記的抗體可以是用免疫動物制備的多克隆抗體或特異性單克隆抗體，最好是特異性強的高效價的單克隆抗體。直接法是將酶直接標記在第一抗體上，間接法是將酶標記在第二抗體上，檢測組織細胞內的特定抗原物質。
2. 納米材料推動免疫診斷試劑盒的開發
隨著材料科學的進步，納米人工材料開始進入免疫診斷試劑的開發領域。納米材料，特別是納米球形材料被廣泛應用于抗體/抗原分子的負載，在眾多復合反應過程中起到增強信號的作用。通過載體的放大，檢測靈敏度可提高幾個數量級，達到準確的定量效果。
圖 1. 納米乳膠粒輔助的免疫檢測；A：免疫比濁反應；B：免疫熒光檢測；C：常規和納米載體輔助的酶聯免疫顯色（HRP辣根過氧化物酶）
A：免疫比濁檢查，檢測原理如圖1A所示，免疫比濁試劑中抗體被固載于納米顆粒表面，當抗體-抗原復合反應發生時，會造成納米顆粒間聚集，通過分光光度計測量相應抗原/抗體添加前后液體濁度的變化。相比傳統的分子間聚集，納米乳膠的團聚體處于納米尺度，會帶來更明顯的信號相應。
B：免疫熒光檢測，檢測原理如圖1B所示，使用亞微米尺度的載體輔助初級抗體，載體粒徑為400-800nm，同樣需要將抗體固載于載體球表面，抗體抓住抗原分子后，再與熒光標記的抗體結合，使載體具有穩定的熒光信號。使用透析法洗滌納米載體，最后使用流式細胞儀進行檢測。
C：納米球輔助的酶聯顯色反應（ELISA），檢測原理如圖1 C所示，使用小尺度載體，載體粒徑為30-200nm，操作方法如常規ELISA操作，使用酶標儀進行讀數。并考察納米載體的引入對檢測靈敏度的貢獻。相比傳統的復合反應過程，納米載體能夠引入更多酶分子（辣根過氧化物酶HRP），帶來更顯著的檢測信號。
3. 適用于抗原/抗體分子負載的納米微載體
圖 2. 納米載體的電子顯微鏡照片；A：放大1E4倍300納米微載體，B：放大4E4倍160納米微載體，C：放大4E4倍410納米微載體
圖
3. 160納米載體固載蛋白前后原子力顯微鏡照片；A：空白球原子力顯微鏡高度圖，B：空白球原子力顯微鏡相位圖，C：表面覆蓋一層谷氨酸脫氫酶后相位圖 在獲得相應抗體/抗原分子基礎上，納米支撐材料的性能成為開發新型免疫檢測試劑的關鍵。為滿足蛋白分子固定化的需要，國家生化工程技術研究中心(北京)經過多年研究,初步建立了納米、亞微米聚合物微球的制備和純化工藝。能夠分別制備出50-800nm多種尺寸、多種表面基團的聚合物微載體，實現了克級的制備規模，部分產品圖片如圖2所示。相比市場上同類產品，我國自主開發的產品真正實現了“表面活性劑零殘留”，在后期純化過程中首次實現了“零絮凝”，達到了更高的質量標準。相比文獻中報道的制備工藝，自主研發工藝將生產效率提高了3-5倍，并且更有利于實現規模化生產。在多種納米球成功制備的基礎上,中心的研究將多種納米載體用于蛋白分子的固載。如圖3所示，通過原子力顯微鏡表征，能夠清楚的分辨出蛋白質分子固載前后，載體界面性能的變化。
納米載體與酶分子的結合方法如圖4所示，使用水溶性碳二亞胺（EDC）活化納米球表面的羧基，使其與蛋白表面氨基形成酰胺鍵。該交聯方法條件溫和，有利于蛋白分子的活性保持。但羧基載體難以固定等電點較低的蛋白分子，在反應條件下，低等電點蛋白分子與載體都帶有負電荷，難以相互靠近。在羧基球的基礎上，通過接枝帶有伯氨基的分子，將羧基載體改性為氨基載體。用相似的方法，活化蛋白分子上的羧基，再同載體表面氨基形成酰胺鍵，或使用氨基間交聯的方式，實現抗體/抗原分子的固定。
圖4. 納米載體與抗體分子偶聯的示意圖；A：羧基載體的交聯途徑；B：氨基載體的交聯途徑
許多免疫制劑公司已經開始采用納米微球來提高自己產品的質量，但國外的納米微球價格昂貴，無形中大大提高了試劑盒的生產成本。而隨著國家對生物材料研究的重視和投入,我國自主開發的納米微球不僅成本較低，而且在質量上實現了“表面活性劑零殘留”，在后期純化過程中首次實現了“零絮凝”，達到了更高的質量標準。相比文獻中報道的制備工藝，自主研發工藝將生產效率提高了3-5倍，并且更有利于實現規模化生產。如果在廣大的試劑盒生產廠家和公司得到廣大應用，無疑會引發試劑盒生產領域的新革命。同時對于打破行業壟斷,提高國人對自主研發產業的信心,無疑也會起到積極的推動作用。
作者：武老師
國際生化工程技術研究中心（北京）
Email：lwu@home.ipe.cas.cn
電話：010-62550875
標簽：
納米微球免疫診斷試劑盒
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com