許　川1/舒為群1,��/張　亮1/曹　佳2/周　新3

(1.第三軍醫大學軍事預防醫學院環境衛生學教研室, 重慶　400038； 2. 第三軍醫大學軍事預防醫學院軍事毒理學教研室，重慶　400038；3. 第三軍醫大學西南醫院燒傷科， 重慶　400038)

 

 

XU Chuan1, SHU Wei-qun1,��, ZHANG Liang1, CAO Jia2, ZHOU Xin3

(1. Department of Environmental Hygiene, School of Military Preventive Medicine, Third Military Medical University, Chongqing 400038; 2. Department of Toxicology, School of Military Preventive Medicine, Third Military Medical University, Chongqing 400038; 3.Institute of Burn Research， Southwestern Hospital，Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)

 

　　【摘要】 背景與目的： 探討大鼠卵巢高純度顆粒細胞培養及鑒定的方法，建立一種簡便、穩定的細胞模型。材料與方法： 選用SD雌性大鼠(21～25 d)，皮下注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)，48 h后用頸椎脫臼法處死，剖取雙側卵巢，采用機械分離方法釋放卵巢顆粒細胞，0.25％胰蛋白酶消化結合低速離心分離細胞，用含15％胎牛血清的DMEM/F12培養基，置于37 ℃，5％ CO2培養箱培養。以HE染色和卵泡刺激素受體(FSHR)免疫組化染色對所培養的卵巢顆粒細胞進行鑒定，用MTT法繪制細胞生長曲線，并檢測細胞培養液雌二醇(E2)和孕酮(P)的分泌量。 結果： 分離培養的卵巢顆粒細胞存活率>90％，細胞純度達到95％以上；體外培養的顆粒細胞對數生長期為48～96 h；顆粒細胞具有正常的分泌雌激素功能，在培養24 h細胞培養液中E2和P的分泌量分別為(10.36±15.89) pg/ml和(77.91± 17.24) pg/ml。 結論： 采用機械分離法結合胰蛋白酶消化及低速離心法分離培養的卵巢顆粒細胞純度高、活性好，用FSHR表達染色鑒定顆粒細胞是一種簡便快速的方法。

　　【關鍵詞】 大鼠； 卵巢； 顆粒細胞； 培養； 鑒定

　　中圖分類號：R730.45文獻標識碼： A　文章編號：1004－616X(2009)03－0234－04

 

　　【ABSTRACT】 BACKGROUND AND AIM: To obtain and identify cultured granulosa cells from the ovary of rats so as to establish a convenient and stable experimental model. MATERIALS AND METHODS: Female SD rats were subcutaneously treated with pregnant mare serum gonadotropin (PMSG). Forty-eight hours after dosing with PMSG, the animals were decapitated and the ovaries were aseptically removed. Granulosa cells were then released by mechanical method, trypsin digestion and low-speed centrifugation separation were used for granulosa cells isolation. Granulosa cells were diluted and incubated in fresh DMEM-Ham's F-12 medium (1∶1) containing 15％ of fetal bovine serum at 37 ℃ in water-saturated environment of 5％ CO2. Hematoxylin ＆ Eosin (HE) and immunohistochemical staining of FSHR were used for ovarian granulosa cell identification. Additionally, the growth curves of granulosa cells and hormone levels at different incubation times were evaluated as well. RESULTS: Over 95％ of the cultured cells were ovarian granulosa cells．The exponential phase of growth was between 48 and 96 hours of incubation. CONCLUSION: More than 95％ of highly purified granulosa cells could be obtained by mechanical method combined with trypsin digestion and low-speed centrifugation. Moreover, identifications of granulosa cells by HE and FSHR staining were quick and convenient approaches.

　　【KEY WORDS】 rat; ovary; granulosa cell; culture; identification 

　　顆粒細胞是卵巢的主要功能細胞，其增殖與分化直接影響著卵泡的生長啟動、發育、排卵、黃體形成以及甾體激素分泌等卵巢功能活動[1－2]。環境中有毒有害物質對人和哺乳動物的生殖毒害和機制至今仍在探索中，進行顆粒細胞體外培養是研究化學毒物生殖毒性的基礎，是探索卵巢內分泌功能及調控機制的重要手段，而如何獲得高質量的顆粒細胞是生殖毒理學研究深入的關鍵。

　　盡管國內外有關哺乳動物卵巢顆粒細胞的體外培養已有文獻報道[3－5]，但迄今為止，尚無明確標準、高效、穩定的的培養方法，本研究旨在通過改進和完善顆粒細胞的體外培養和鑒定方法，為進一步開展顆粒細胞體外生殖毒理學研究奠定基礎。

 

　　1　材料與方法

　　1.1　主要試劑和儀器

　　DMEM/F12培養基購自美國HyClone公司，無支原體胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司, 孕馬血清促性腺激素(PMSG)購自杭州動物藥品廠，四甲基偶氮唑鹽(MTT)、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，DAB顯色試劑盒、卵泡刺激素受體(FSHR)兔多克隆抗體購自武漢博士德公司，伊紅、蘇木素購自北京中杉金橋生物工程有限公司。雌二醇(E2)、孕酮(P)放射免疫測定試劑盒購自北京原子高科股份有限公司。

　　主要儀器包括組織培養顯微鏡，光學顯微鏡(Olympus)，CO2培養箱(Thermo Forma)，全自動酶標儀(Thermo)，離心機(湖南湘儀)，GC-911 γ放射免疫計數器(中佳光電儀器分公司)等。

　　1.2　實驗動物

　　21～25日齡(50～60 g)清潔級健康SD大鼠10只，雌性，由第三軍醫大學實驗動物中心提供。

　　1.3　卵巢顆粒細胞的分離與原代培養

　　參照Lovekamp等[3]介紹的方法加以改進，雌性SD大鼠，每只皮下注射PMSG 40 IU，48 h后頸椎脫臼法處死。碘伏、酒精消毒，在無菌條件下迅速剖取卵巢放入預冷的無菌PBS中，去除卵巢周圍組織及表面包膜，PBS清洗后置于預冷的DMEM/F12培養基中。在解剖顯微鏡下用25號針頭刺破卵泡，使顆粒細胞釋放入  DMEM/F12培養基，離心管內吹打分散成單個懸浮細胞。加入0.25％胰蛋白酶－0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)1 ml，于37 ℃，5％ CO2培養箱中消化60 min，期間從培養箱取出用吸管反復吹打懸液2～3次(以組織消化為黏液狀、顆粒細胞團塊分離為準)，加入含有胎牛血清的培養液終止消化，200目不銹鋼細胞篩過濾。800 r/min離心5 min，洗滌濾液，棄上清收集細胞。向沉積在離心管底的疏松細胞團中加入DMEM/F12培養基(含15％胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素) 制成單細胞懸液。臺盼藍染色，計數。將細胞稀釋成濃度為3.0×105/ml的細胞懸液，接種于培養瓶中或培養板中，在37 ℃、5％ CO2培養箱中預培養24 h后換液1次，去除未貼壁細胞；此后隔日換液1次。

　　1.4　顆粒細胞鑒定

　　1.4.1　HE染色　取生長旺盛的第4 d的細胞，用0.25％胰蛋白酶－0.02％EDTA消化后制成1×105/ml的細胞懸液，種植于已預置好小蓋玻片的24孔培養板中，放人CO2 培養箱中，在37 ℃、5％ CO2及完全飽和濕度條件下進行培養。當細胞生長至70％融合時取出玻片，用PBS沖洗蓋玻片3次，每次5 min。4％多聚甲醛固定20 min。取出細胞爬片，PBS沖洗2次，蘇木素染色2 min，流水沖去浮色，入鹽酸酒精中分色數秒，流水沖洗3 min，鏡下細胞核染色清晰，胞漿不著色。5％伊紅染色2～3 min，流水沖去浮色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片后光鏡下觀察細胞形態。

　　1.4.2　FSHR表達鑒定顆粒細胞　細胞爬片制作同前，4％多聚甲醛固定。按以下步驟進行細胞免疫化學染色：固定好的細胞爬片，PBS洗滌3 min×3次；3％ H2O2室溫孵育5 min，消除內源性過氧化物酶活性，PBS清洗5 min×3次；加正常山羊血清封閉無關抗原，室溫下孵化20 min，傾去不洗。滴加一抗FSHR兔多克隆抗體(1∶200), 4 ℃過夜，PBS清洗 5 min×3次。滴加二抗IgG，37 ℃孵育 60 min；PBS清洗5 min×3次。滴加辣根酶標記鏈霉素工作液50 μl， 37 ℃孵育 30 min；PBS清洗5 min×3次。DAB 顯色(顯微鏡下控制顯色時間)；自來水沖洗，蘇木素復染10 min；自來水沖洗3次；常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

　　1.5　細胞生長特性觀察

　　將分離得到的細胞按每孔1×104個接種于96孔板，每孔200 μl。在培養過程中每24 h對試驗組進行1次檢測，每次檢測6個孔，直至接種培養后的第9 d，取各時間點平均值。檢測時，每孔添加180 μl 不含血清的培養液和20 μl MTT(5 mg/ml)，37 ℃繼續孵育4 h，小心吸棄孔內培養液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩    10 min，自動酶聯免疫檢測儀上測定490 nm處的吸光度值(A)，以吸光度值為縱坐標，時間為橫坐標繪制細胞生長曲線。

　　1.6　雌二醇(E2)和孕酮(P)含量

　　將生長旺盛細胞接種到24孔培養板，用含15％胎牛血清的DMEM/F12培養基培養細胞，細胞密度為1.0×105/ml，每孔l ml，37 ℃、5％ CO2條件下培養   12 h、24 h后分別收集細胞培養液(在終止培養前3 h加入100 ng/ml FSH)，用放射免疫法測定雌二醇(E2)和孕酮(P)的含量，以評價細胞的功能狀態。

 

　　2　結　果

　　2.1　卵巢顆粒細胞形態學觀察

　　臺盼藍染色表明，實驗分離培養細胞的存活率>90％，初始階段細胞形狀呈圓形或橢圓形，其中有部分小而圓的其他細胞(如紅細胞)。卵巢顆粒細胞呈單層貼壁性生長，培養24 h后細胞開始貼壁、增殖；培養48 h后細胞明顯增殖，貼壁良好，生長旺盛(見圖1，2)。經HE染色后，在鏡下可見貼壁細胞形態完整，邊緣清晰，大小均一，呈多角形或梭形，核染深藍色呈卵圓形或不規則形，胞漿淡紅色(見圖3)。卵巢顆粒細胞形態結構與文獻報道一致。

 

　　2.2　FSHR表達鑒定顆粒細胞

　　FSHR免疫細胞化學染色是卵巢內顆粒細胞的特異性染色，FSHR陽性染色定位于細胞胞漿，呈棕褐色著染，細胞核呈深藍色，鏡下可見FSHR的陽性率>95％(見圖4)，由此表明分離培養的顆粒細胞純度達到95％以上。

 

　　2.3　細胞生長曲線

　　細胞生長曲線見圖5。由圖可見，卵巢顆粒細胞培養初期隨著培養時間的延長而增殖，培養24 h細胞處于貼壁生長適應期，A值增加不顯著，培養48 h后A值開始大幅度的增高，判斷細胞迅速進入對數生長期，到72 h細胞生長極度旺盛，A值達到最大值；隨后進入平臺期，第5 d開始逐漸下降，6 d開始顯著下降直至第  9 d結束吸光度測定。

　　2.4　雌二醇(E2)和孕酮(P)的分泌

　　12 h、24 h的卵巢顆粒細胞培養液E2和P的分泌量見表1，培養液中E2和P的分泌量隨著培養時間的延長均升高，培養24 h后E2和P水平均值分別達到103.36 pg/ml和77.91 pg/ml。

 

　　3　討　論

　　隨著生殖毒理學研究的深入，環境化學毒物引起的各種女性生殖損害已引起了人們的高度重視，通過有效地研究環境有毒有害因子對卵巢顆粒細胞生長發育的影響及其調控機制，可深入了解毒物對卵巢毒性作用機理。目前，毒理學研究中對卵巢顆粒細胞的應用越來越廣。如何簡便、快速、穩定的分離和培養卵巢顆粒細胞是研究化學毒物生殖毒性的基礎和必要手段。

　　結合已有文獻報道，本實驗采用21～25 d雌性SD大鼠進行卵巢顆粒細胞體外培養，相比成年大鼠而言，新生大鼠顆粒細胞在離體前未接觸過內源性促性腺激素的刺激，采用PMSG刺激雌性SD大鼠使之處于動情前期，獲得大量相同發育階段的顆粒細胞。進而采用機械分離方法使顆粒細胞釋放出來，既減少了對細胞的損傷，保持細胞形態完整，又使污染細胞減少。胰蛋白酶消化結合低速離心分離卵巢顆粒細胞可去除其他混入的細胞(如紅細胞)及組織碎片，提高顆粒細胞存活率和純度。體外培養24 h后顆粒細胞開始貼壁生長，48～96 h內細胞大量增殖，生長旺盛，并可獲得較高的細胞存活率，實驗結果與文獻報道一致[3－4]。

　　鑒于顆粒細胞是卵巢內唯一可表達FSHR的細  胞[6－7]，筆者在通過HE染色觀察顆粒細胞形態學特點的基礎上，特別采用細胞FSHR表達陽性作為鑒定顆粒細胞的標準。結果表明，在培養的顆粒細胞中，FSHR的陽性率可達到95％以上，獲得的高純度顆粒細胞可最大程度保存細胞的特性，將使系列生殖毒理有關實驗數據更加可信。卵泡顆粒細胞在維持雌性生殖功能上具有重要作用，顆粒細胞分泌雌激素為卵細胞的生長和發育提供了重要的微環境。實驗期間，顆粒細胞培養液中E2和P分泌量隨著時間增加而升高，表明培養的細胞具備并可維持正常的生理功能。

　　綜上所述，純度高、活性好的原代培養顆粒細胞可為化學毒物毒性評價提供一個很好的實驗基礎。本實驗所建立的細胞培養體系是可行的、理想的，適合進行相關毒理學實驗。

 

　　參考文獻：

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收稿日期： 2008－10－27； 修訂日期： 2008－12－24

基金項目： 國家自然科學基金重點項目(30630056)；國家自然科學基金青年科學項目(30800900)；重慶市重大科技專項 (CSTC2006AA7003)

作者簡介： 許川(1980－　)，男，湖北荊門人，主治醫師，博士研究生，研究方向：環境毒理學。E－mail:xuchuan100@163.com.

Correspondence to： SHU Wei-qun, E－mail: wqshu@mail.tmmu.com.cn