葉綠體DNA分離
瀏覽次數:2608 發布日期:2008-12-30
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設備:Hitachi CS-150GXL或CS-120GXL微量超速離心機,S100AT6 轉頭,5PA 密封管(如果用4PC管,可接比例減少各層液量)
溶液配制:
A液:0.35Msorbitol(山梨醇),50mM Tris—Hcl (PH8.0) 25mM EDTA—Na2
B液:5%(w/w)Sodium N—lauroyl Sarcosinate (N—月桂肌氨酸鈉)
方法:CsCl 平衡等密度離心方法 (equilibrium isopycnic)
分離步驟:
1.5ml 葉綠體稀釋加5ml A液
2.CF7D2 或同類離心機 2500rpm 4℃,15分鐘,50ml ,PP管
3.(2)的沉淀加20—30ml A液“洗”2—3次(用(2)參數離心2—3次)
4.(3)的沉淀加2ml A液及 pronase (鏈霉蛋白酶)
5.培養:37℃,2小時。取出后室溫平衡2分鐘
6.混合器混勻(15分鐘)
7.再培養4℃,(2—3)小時
8.離心:2500rpm,4℃,15分鐘,上清液為粗制DNA液
9.超速離心加樣:5 ml 密封管,樣品((8)的上清)3.61 ml 加入3.35g CsCl,E.B (ethidium bromide) (澳化乙錠) (10mg/ml):50ul。溶液CsCl密度為ρ=1.55g/cm3 ,混勻后密封(用日立STF2自動熔封器)
注:以上是單管配置,如配雙管或多管,則所有步驟容量都增加倍數。
10.離心:日立CS—150GXL或CS—120GXL 離心機或同類機型S100AT6轉頭,5ml密封管。70,000rpm(約296,000xg,K=37),離心16小時,20℃,加速“9”,減速“7”。
注:由于對同一樣品離心時間與K近似值成正比,使用其他型號轉頭可參照實際的K值決定離心時間
11.結果:在離心管中部可見明顯的寬約2mm的葉綠體DNA條帶,用講座文章3a篇中的方法取出。