隨著超速離心機(jī)轉(zhuǎn)速的提高，用超速角式轉(zhuǎn)頭分離人血清中白蛋白與球蛋白的離心時(shí)間越來越短，用5—20％線性蔗糖梯度作蛋白質(zhì)速率—區(qū)帶（Rate—zonal）分離，樣品以近等速沉降，低于分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。下面的簡(jiǎn)單分離實(shí)例有代表性。

 

設(shè)備：

離心機(jī)：智能型超速離心機(jī)（Hitachi CP—M系列，Beckman L—XP系列）

轉(zhuǎn)頭：定角：P90AT，P80AT，比較實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)頭：P40ST

P90AT:  90,000rpm,  700,000xg,  8×12ml   K=25

P80AT:  80,000rpm,  615,000xg,  8×12ml   K=27

P40ST:  40,000rpm,  284,000xg,  6×13ml   K=139

離心管：12ml及13ml PA管

 

樣品：標(biāo)準(zhǔn)人血清1 ml （2.5mg/ml），用0.15M NaCl溶解。

 

梯度液：5—20％ 線性蔗糖梯度， P90AT及P80AT梯度液量約9.5ml ，P40ST梯度液量約9.6ml。

 

方法：5—20％蔗糖梯度液上鋪約1ml 人血清，對(duì) P90AT及P80AT必須裝滿（用血清調(diào)節(jié)），P40ST加樣至距管口3mm。

 

離心參數(shù)：

P90AT：90,000rpm，2小時(shí)，2.5小時(shí)，3小時(shí)，5℃，加速“5”減速“5”

P80AT：80,000rpm，2小時(shí)，2.5小時(shí)，3小時(shí)，5℃，加速“5”減速“5”

P40ST：40,000rpm，14小時(shí)，16小時(shí)，18小時(shí)，5℃，加速“8”減速“8”

曲線繪制：用日立DGF—U 梯度儀通過上口連續(xù)取樣至帶流動(dòng)池分光光度計(jì)連續(xù)測(cè)O.D.（280nm）后收集。

 

結(jié)果及分析：

 

 

 

 

分析：根據(jù)以上結(jié)果，可以看出：

1．在5—20％蔗糖線性梯度中白蛋白與球蛋白基本上以等速沉降

2．用P40ST或P80AT轉(zhuǎn)頭分離人血清白、球蛋白在最高轉(zhuǎn)速離心2.5小時(shí)效果最佳，用P40ST轉(zhuǎn)頭離心18小時(shí)效果最好。

3．用P40ST轉(zhuǎn)頭分離的結(jié)果O.D. 對(duì)離心管從管口算起容量曲線的峰形比P90AT的峰形尖銳一些，但考慮到離心機(jī)和轉(zhuǎn)頭的壽命，用P80AT 轉(zhuǎn)頭離心性價(jià)比最佳。

 

作者：余興明   電話：13764301893,yuxingming@techcomp.cn