張 亮¹ 閻瑾琦¹馬繼堯² 王 浩¹ 劉 寧¹ 賈銳¹ 韓 剛² 董金凱² 田仁禮² 于繼云[1]

1.軍事醫(yī)學科學院 基礎醫(yī)學研究所，北京 100850； 2.解放軍總醫(yī)院 泌尿外科，北京 100853

 

[摘要]
目的：建立基因槍子彈制備以及轉染體外培養(yǎng)cos-7細胞系的方法，觀察基因槍介導真核表達質粒pVax-Dsred-IRES-EGFP在細胞內的表達情況。
方法：亞精氨、氯化鈣沉淀法制備子彈，利用原子力顯微鏡觀察子彈制備（DNA+金顆粒）情況；以基因槍的方法分別轉染對照組和實驗組cos-7細胞，在轉染后24小時，利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細胞中紅、綠熒光蛋白的表達。
結果：成功制備基因槍子彈，DNA緊密包裹在金顆粒周圍。基因槍介導的pVax-Dsred-IRES-EGFP成功轉染入體外培養(yǎng)的cos-7細胞，在轉染后24小時可檢測到紅、綠熒光的表達，而對照組則沒有檢測到熒光蛋白的表達。
結論：本實驗證明國產新芝SJ-500型基因槍能夠有效介導外源基因轉移，基因槍轉染的cos-7細胞能夠有效表達報告基因，本研究為小鼠腫瘤模型的免疫治療奠定了基礎,為基因槍介導的DNA疫苗經皮免疫提供了可靠實驗依據。

[關鍵詞]
基因槍；細胞轉染；真核表達載體；熒光蛋白；cos-7

 

基因治療對于多種疾病，尤其是對惡性腫瘤、遺傳性疾病、傳染性疾病的治療具有巨大的應用前景^[1,2]。問題的關鍵在于如何建立一個安全、高效的基因導入系統(tǒng)，為此，人們試驗和嘗試發(fā)展了數十種病毒型和非病毒型載體運用于臨床研究。然而，2000年美國賓州大學以重組病毒為載體的基因治療藥物臨床試驗造成了受試者死亡^[3]，后來的研究發(fā)現病毒型載體有可能改變被轉染細胞的主要功能和局部環(huán)境^[4],從而引發(fā)了人們對病毒型載體安全性的憂慮。因此,以非病毒為載體的基因轉移研究顯得越發(fā)重要，其中基因槍法因其具有其他方法所不具有的高效和便捷的特點, 日益受到科研工作者的矚目^[5]。本研究室近期引進了國產新芝SJ-500型手提式基因槍，用于腫瘤免疫基因治療的實驗研究。為了驗證該設備導入外源基因的有效性，遂進行本研究。在使用過程中發(fā)現利用基因槍轉染基因方便、安全、有效，具有很好的臨床應用前景。

1.1　材料

重組真核表達質粒pVax-Dsred-IRES-EGFP為本室構建，為含有紅、綠熒光蛋白報告基因的雙順反子真核表達載體質粒，可以在轉染的真核核細胞中同時表達紅、綠熒光蛋白；cos-7細胞為本室保存；DMEM培養(yǎng)基為Gibco BRL公司產品；新生牛血清購自杭州四季青責任有限公司；新芝SJ-500型手提式基因槍、吹氮干燥儀購自寧波新芝生物科技股份有限公司；金粉購自AlFa Aesar；氦氣、無水乙醇均為軍事醫(yī)學科學院科研條件處供應。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組

將傳代培養(yǎng)的cos-7細胞在轉染前一天分至60mm細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，使其在轉染當天生長密度達到80%-90%。對照組和實驗組每組各3塊培養(yǎng)板，對照組的子彈不加入質粒DNA，實驗組子彈每發(fā)含有1.5μgDNA。子彈制備過程同1.2.2。

1.2.2 基因槍子彈制備

精確稱取60mg金粉，加入1ml無水乙醇，超聲波粉碎機超聲3-5分鐘，待手感發(fā)燙時12000rpm離心去除上清。在沉淀中加入1ml無水乙醇,混勻，12000rpm離心去除上清，重復上述過程二次，離心后在沉淀的金粉中加入1ml無水乙醇重懸,4℃冰箱保存。

制備子彈時，取400μl上述混合液離心，去除上清后加0.1M亞精氨160μl，輕輕混勻，然后加入1.5μg/μlpVax-Dsred-IRES-EGFP質粒50ul（空白組加入等量的去離子水），渦旋輕混時，逐滴加入2.5M氯化鈣400μl，混勻后室溫沉淀10分鐘，待上清液變清亮離心15秒，去除上清，加入1ml無水乙醇重懸沉淀，12000rpm離心5秒，去上清，重復上述過程二次。加入3ml無水乙醇重懸沉淀。將金顆粒-質粒DNA乙醇溶液吸入Tefzel管中,使金顆粒沉淀在管的內表面上,吸去乙醇,用氦氣將管吹干,將管切成約1.5cm的小段即制成子彈。

1.2.3 基因槍介導的pVax-Dsred-IRES-EGFP轉染體外培養(yǎng)的cos-7細胞系

轉染時，將培養(yǎng)皿中的細胞培養(yǎng)也液倒掉，將基因槍連接至氦氣鋼瓶，將壓力調為1000kpa，轟擊距離設定為2cm，轟擊培養(yǎng)的cos-7細胞系一槍。對照組和實驗組各轟擊3塊培養(yǎng)皿，轉染pVax-DsRed-IRES-EGFP后,將細胞置入37℃,5%CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。轟擊后24小時,取對照組和實驗組的細胞系在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察熒光表達情況。