摘   要：2006年國家出臺的《嬰幼兒配方乳粉生產許可證審查細則》中明確要求采用國際通行的“熒光PCR儀”作為出廠檢驗必備設備，此要求已成為乳品企業生產許可證核發的必要條件。本文簡單綜述了國際通行的保證食品安全的食源菌檢測標準、儀器和方法。介紹了乳制品高危致病菌——阪崎腸桿菌的危害、檢測必要性以及檢測方法的歷史演變。在介紹熒光PCR技術特征的同時，重點論述了熒光PCR方法檢測乳品中阪崎腸桿菌的政策要求、技術標準、實驗技術、檢測步驟以及實驗室建設要點。

本文以具有自主知識產權的國產熒光PCR儀及試劑為例，具體介紹了阪崎腸桿菌檢測過程和篩選判別實例。

關 鍵 詞：食品安全、食源菌、乳品檢測、阪崎腸桿菌、熒光PCR儀、快速檢測

世界貿易的全球化同時也帶來了食品安全風險！食品安全是全球日益關注的一個重要的公共衛生問題。全球每年發生食源性疾病數十億例，發達國家發生食源性疾病的概率也相當高，平均每年1/3的人群感染食源性疾病。 近年來，世界范圍內屢屢發生大規模食品安全事件，如：日本上萬人葡萄球菌腸毒素導致的雪印牛奶中毒、英國的瘋牛病、法國的李斯特氏病毒、泰國的禽流感、比利時的二惡英事件等。

每年由數十億例食源性疾病而導致的醫療費增加、不安全食品的召回、以及產品的銷毀帶來的經濟損失不可估量！食品安全引起的“食物恐怖”：以食源菌或化學性、生物性、放射性等有害物質污染甚至蓄意污染食品，導致人群傷害或死亡，破壞社會經濟或政局穩定的行動或危險越來越被人們所重視，如大頭娃娃和毒餃子事件，無一不給我們敲響警鐘。

其中食源菌污染是導致以上事件的主要原因，因此制定食源菌檢測標準、采用國際通行的檢測儀器以及研制和使用具有自主知識產權的國際通行檢測儀器是被學界、政府、企業界和人民群眾公認為目前的當務之急。本文就乳制品中高危害致病菌——阪崎腸桿菌的檢測做一些簡要的分析。

1.阪崎腸桿菌的危害及檢測的必要性

阪崎腸桿菌是奶粉(乳)制品中新發現的一種致病菌，可以引發嬰兒、早產兒腦膜炎、敗血癥及壞死性結腸炎散發和暴發。研究報告表明嬰幼兒配方奶粉是主要感染渠道,由阪崎腸桿菌引發疾病而導致的死亡率可達40％～80%，已引起世界多國的重視。

阪崎腸桿菌已引起世界多國相關部門的重視。據報道,國外乳業巨頭曾因此被召回.在美國FDA2002年在本土某一些國際乳業巨頭生產的嬰兒配方奶粉中檢出阪崎腸桿菌后，2003年又一家國際乳業巨頭公司主動召回在美國生產的一批檢出極微量阪崎腸桿菌的罐裝早產兒特殊配方奶粉，阪崎腸桿菌從此成為世界矚目的焦點。但是幾年前國內企業鮮有自查能力,原因是國內以前還沒有專門的檢測手段,而去買一套以前國內從未有過的檢測設備也不是馬上就可辦到的。目前,國外奶粉(乳)制品巨頭就以擁有先進檢測手段作為一個有力的宣傳點,比如惠氏（中國）宣稱保證在中國銷售的每一個產品都經過了阪崎腸桿菌的檢測才上市；同樣宣稱擁有此檢測設備的企業還有美贊臣（中國）公司。

在國外發現的奶粉中的阪崎腸桿菌并非有其特定的區域局限性，中國奶粉企業又面臨一項大難題。值得慶幸的是：2005年5月20日，由中國檢驗檢疫科學研究院和天津出入境檢驗檢疫局牽頭完成的《奶粉中阪崎腸桿菌檢測方法》行業標準在京通過了審定。這項標準的出臺，解決了我國檢測嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌無標準、無檢測方法的問題。同年10月該標準被實施。與之配套2006年出臺了06版乳品企業生產許可證《關于印發食用植物油等26個食品生產許可證審查細則的通知》，其中《附件8：嬰幼兒配方乳粉生產許可證審查細則(2006版)》里明確規定采用國際通行的“熒光PCR儀”為出廠檢驗必備設備。另外多部國家標準明確要求用PCR方法檢測阪崎腸桿菌、食品中致病菌等。

如«中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準»SN/T 1632.1—2005奶粉中阪崎腸桿菌檢驗方法 第1部分：分離與計數方法；第2部分：PCR方法；第3部分：熒光PCR方法；

SNT 1204-2003 植物及其加工產品中轉基因成分實時熒光PCR定性檢驗方法；

SNT 1635-2005 貝類中諾沃克病毒檢測方法 普通RT-PCR方法和實時熒光RT-PCR方法等

實時熒光定量PCR技術正是采用國際通行的檢測標準，進行阪崎腸桿菌的檢測。除應用于乳品企業外，還大量應用于食品加工企業、醫療機構等。

為了打破國外先進食源菌分子檢測儀器在我國的壟斷地位，同時降低食品加工企業擁有該類儀器的門檻，近年來我國政府十分重視扶持具有自主知識產權的實時熒光定量PCR儀器的開發和推廣工作。據《中國乳品工業》2007年總第198期，國產實時熒光定量PCR儀已通過性能檢測、，臨床試驗，獲得了醫療器械注冊證。在多家乳品生產、食品加工、醫療機構推廣應用，效果良好。性能達到國際同類產品先進水平。

2.阪崎腸桿菌的檢測方法

常用病原菌檢測品種：沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、小腸結腸炎耶爾森式菌、單增李斯特氏菌、空腸彎曲桿菌等。包括阪崎腸桿菌。

檢測方法的歷史演變：通常檢測食物病原體有多種方法，如18世紀初，僅僅是通過常規尿液和血液成分檢測肝病、腎病；18世紀中，體液酶的分析通過堿性磷酸酶檢測肝功能； 血清淀粉酶檢測胰腺炎；酶類標志物檢測心臟病；19世紀，放射及酶聯免疫分析激素檢測內分泌功能；腫瘤標志物檢測癌癥；蛋白標志物檢測心臟病；到了20世紀，生化檢測血糖等——糖尿病、心血管；生理參數——心血管病等；21世紀，應用分子生物學，通過實時定量PCR分子診斷儀實現基因診斷：食品安全、病原體及傳染、腫瘤、遺傳病等

各種檢測方法從靈敏度、特異性、抗污染、易操作性四方面比較表明，PCR檢測方法具有靈敏度高、特異性強、抗污染能力強｛熒光PCR｝、容易操作等特點。

PCR檢測方法又分為三種：熒光法、電泳法、ELISA法。分析對比圖見下表：

3.熒光PCR方法簡述

PCR歷史發展的三個階段：定性PCR（電泳法）、酶免法 定量PCR、實時熒光定量PCR。實時熒光定量PCR技術比定性PCR技術發明晚將近十年，相比定性PCR，它有如下突出優點：

熒光定量PCR 反應過程實時監測、熒光定量重復性好、基因定量分析——穩定性好、熒光檢測——濃度梯度試驗線性范圍寬、熱循環升降溫快速、熒光定量在對數期進行定量分析等優勢。

西安天隆TL988熒光定量PCR儀曲線

4.熒光PCR實驗室建設要點

由于PCR技術特別靈敏，為防止試驗過程交叉污染，應根據《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》衛醫發[2002]10號和《臨床基因擴增檢驗實驗室工作規范》衛檢字[2002]8號相關要求，對PCR實驗室進行防污染布局和管理。PCR實驗室原則上應分為四個隔開的工作區域，每一區域都應有專用的儀器設備，分別是1 試劑儲存和準備區、2 標本制備區、3擴增反應混合物配制和擴增區、4擴增產物分析區。根據管理辦法規定，如果使用實時熒光定量pcr儀，各區域可適當合并，我們建議將擴增區和產物分析區合并為擴增檢測區即共三個間。

5.阪崎腸桿菌熒光PCR檢測步驟（以西安天隆科技有限公司生產的TL988型實時熒光定量PCR儀及阪崎腸桿菌檢測熒光試劑為例）

[標本取樣]   取樣前消毒樣品包裝的開啟處和取樣工具。按照“三管”增菌法，無菌稱取100g，10g和1g樣品各三份分別加入2L，250ml，125ml的樣品稀釋瓶中，加入9倍預熱到45℃的滅菌水[1：10稀釋]，或者將樣品直接稱量到裝有9倍預熱的45℃的滅菌水的樣品稀釋瓶中，振蕩使樣品充分混勻，36℃±1℃培養18～22h。

    分別移取培養18～22h的懸液各10ml加入90ml腸桿菌增菌肉湯[EE肉湯]中，36℃±1℃培養18～22h。

[檢測步驟]

試劑制備

取出反應管N支（N＝樣本數＋1管陽性對照＋1管陰性對照），瞬時離心后，存于4℃備用。

DNA提取

標本處理：每瓶培養的EE肉湯分別取1ml加到1.5ml無菌離心管中，8000r/min離心5min，盡量吸棄上清液；加入50ulDNA提取液[使用前室溫解凍并充分混勻，快速吸取]，混勻后沸水浴10min,12000r/min離心5min,取上清液2ul做模板進行PCR反應。

PCR擴增

---加樣 取出備用的PCR反應管，分別加入處理后的樣品上清2ul，陰陽性對照直接加2ul，瞬時離心后放入儀器樣品槽進行PCR反應。 

---編輯  2．1點擊新建文件，輸入實驗文件名稱  2．2對應樣品槽樣本放置順序設置陰、陽性對照以及未知標本，并在Name攔中設置樣品名稱。 2．3 換到溫度設置窗口設置循環條件：如下

編輯完成后點擊開始運行，出現熱蓋溫度是否等待，請點擊是。

試驗有效性判定  設定閾值線高于陰性對照最高點，陽性對照的Ct值＜25，反應有效。

結果判定 設定閾值線高于陰性對照最高點， 檢驗樣本Ct值小于或等于25.0時，報告阪崎腸桿菌篩選陽性；檢驗樣本Ct值大于25.0且小于30.0時，重復一次，如果Ct值仍小于30.0，且曲線有明顯的對數增長期，可報告阪崎腸桿菌篩選陽性，否則報告阪崎腸桿菌未檢出；樣本檢驗不到Ct值時，或Ct值為0時，報告阪崎腸桿菌未檢出。