使用原子力顯微鏡(AFM)觀察生化過程

  隨著樣品處理技術在液體中成像技術的改善，應用原子力顯微鏡(AFM)觀察復雜的生化過程成為可能。轉錄過程是基因表達的中心環節，而使用原子力顯微鏡(AFM)觀察蛋白質和DNA的相互作用存在一個矛盾要解決：生物分子需要固定到基底上是原子力顯微鏡(AFM)的成像基礎，而生化反應過程卻需要生物分子能相對自由地移動。即使在大量非特異性DNA存在時，RNA聚合酶(RNAP)與啟動子間仍存在很高的結合率，人們猜想RNAP沿著DNA的擴散是其原因之一。非特異性復合物在適當條件下沉積后，利用原子力顯微鏡(AFM)可觀察到RNAP沿著DNA滑動，且能在不同的DNA片段間轉移。然而加入肝素可終止這些過程，這就進一步證實了RNAP- DNA相互作用的非特異性。原子力顯微鏡(AFM)還能對轉錄的過程進行實時觀察，在加入核苷酸后，沉積到云母上的延長復合物沿著DNA模板單向移動。兩個對照實驗證實RNAP與DNA的相對移動與轉錄的實際情況相符。在一個對照中，以沒有終止子的微環DNA作為模板，在云母上進行轉錄。在干燥后通過原子力顯微鏡(AFM)可觀察到合成的ＲＮＡ長鏈。在第二個對照中，DNA在相同的條件下，在云母上進行轉錄。不同的是加入的核苷酸用32Ｐ標記。通過PAGE對反應產物進行分析，結果顯示與云母結合的復合物具有活性，而且轉錄的速度與用原子力顯微鏡(AFM)測得的近似生物分子的構象改變也是原子力顯微鏡(AFM)的重要觀察內容。將尿素酶沉積到云母上并用原子力顯微鏡(AFM)掃描，在液池中加入尿素后發現,懸臂的垂直波動明顯增加，這提示由酶活動引起的構象改變能直接通過原子力顯微鏡(AFM)記錄下來。格蘭陰性菌的外膜是其保護屏障，它由規則組裝的蛋白質通道構成。其中研究較多的是Deinococcusradiodurans的六角形組裝中間體(hexago nallypacked intermediate, HPI)蛋白。HPI被認為與營養的攝入和代謝物的排出有關。HPI的原子力顯微鏡(AFM)圖像顯示了規則的六角形及中央的孔樣結構。在液體中成像則發現HPI呈現出“開和“關”兩種不同的構象。意義雖不清，但這卻顯示出原子力顯微鏡(AFM)在液體中成像的優勢。

  原子力顯微鏡(AFM)在研究分子識別中的應用分子間的相互作用在生物學領域中相當普遍,例如受體和配體的結合,抗原和抗體的結合,信息傳遞分子間的結合等,是生物體中信息傳遞的基礎。原子力顯微鏡(AFM)可作為一種力傳感器來研究分子間的相互作用。這是由于原子力顯微鏡(AFM)理論上能感應10-14Ｎ的作用力,能感應0.01ｎｍ的位移,而接觸面積可小到10ｎｍ2。因此,原子力顯微鏡(AFM)被用于研究互補的DNA鏈間、細胞粘附分子間及配體-受體間的相互作用力。生物素(biotin)和抗生物素蛋白鏈菌素(streptavidin)間有高親和力,其相互作用的熱力學數據也較為清楚。因而,生物素和抗生物素蛋白鏈菌素是原子力顯微鏡(AFM)測定特異相互作用力的良好典型。在一經典實驗中，用生物素化的小牛血清白蛋白(biotinlated bovine serum albumin，BBSA)包裹微球，而微球連在懸臂上形成BBSA功能化探針。然后在有生物素阻斷和無生物素阻斷的抗生物素蛋白鏈菌素溶液中測量BBSA功能化探針和BBSA包裹云母間的粘附力。結果顯示,無生物素阻斷的抗生物素蛋白鏈菌素溶液中需要較大的力才能將BBSA功能化探針與云母表面分離，力的大小為(0.257±0.025)ｎＮ，與分離配體-受體所需的力相符。而在此基礎上可推算出其有效的斷裂距離為(0.95±0.10)ｎｍ。因此，當針尖包裹了特定的分子(如生物素)后,通過針尖和樣品間的相互作用可用于辨認表面的相應分子(如抗生物素蛋白鏈菌素)的位置。現在已出現了商用的修飾探針，這些探針包裹了不同的分子，可用于不同用途的分子識別。因而原子力顯微鏡將發揮更廣泛的作用。

  原子力顯微鏡(AFM)在物質超微結構研究中的應用原子力顯微鏡(AFM)可以直接觀察到表面缺陷、表面重構、表面吸附體的形態和位置、以及有表面吸附體引起的表面重構等。原子力顯微鏡(AFM)可以觀察許多不同材料的原子級平坦結構，例如，可以用原子力顯微鏡(AFM)對DL－亮氨酸晶體進行研究，可觀察到表面晶體分子的有序排列，其晶格間距與X射線衍射數據相符。另外原子力顯微鏡(AFM)還成功地用于觀察吸附在基底上的有機分子和生物樣品，如，三梨酸、DNA和蛋白質的表面。海藻酸聚賴氨酸海藻酸(Alginate Poly L-Lysine Alginate,簡稱APA)膠囊薄膜具有半滲透性，構成可以阻止人體免疫系統的成分進入由APA薄膜構成的膠囊,從而使得膠囊內的物質免受免疫系統的侵害。因此,可采用該薄膜膠囊保護人體內移植的組織,延長其在人體內的存活時間。同時,對藥物具有緩釋效應。APA薄膜的半滲透性同其表面的超微結構有著密切的聯系,研究其表面的超微結構對其半滲透性的研究具有重要的意義。已有文獻報道了關于采用原子力顯微鏡(AFM)對APA薄膜的表面結構進行研究的內容，發現了APA表面的特殊結構，從而揭示了APA表面超微結構對半滲透性的重要意義。目前，利用原子力顯微鏡(AFM)已獲得了DNA、透析薄膜、烷烴分子、脂肪酸薄膜以及多糖等的超微結構的圖象。

原子力顯微鏡(AFM)在細胞生物學中的應用

  應用原子力顯微鏡(AFM)可研究活細胞或固定細胞如紅細胞、白細胞、細菌、血小板、心肌細胞、活腎上皮細胞及神經膠質細胞的動態行為。原子力顯微鏡(AFM)對體外動態細胞的分析具有非凡的能力。這些研究大都把樣品直接放置在玻片上，不需要染色和固定,樣品制備和操作環境相當簡單。用免疫膠體金標記細胞膜則打開了細胞表面抗原高分辨定位之門。原子力顯微鏡(AFM)細胞成像如：用原子力顯微鏡(AFM)研究活腎上皮細胞，可在漿膜小斑上以50nm的分辨率觀察細胞骨架元素、漿膜淺凹和膜結合絲。用原子力顯微鏡(AFM)觀察血小板的運動,可看到微絲結構、顆粒傳輸到細胞質外側及活化中細胞成份的再分配。游走上皮細胞的漿膜可用原子力顯微鏡(AFM)實時成像。用原子力顯微鏡(AFM)以50nm的分辨率可觀察水中活的或固定的哺乳動物細胞表面骨架結構，在活細胞中可及時跟蹤細胞構形的變化，引入藥物(秋水仙素)導致的細胞骨架結構表面受體交聯(通過IgE抗體與IgE受體結合)等,還可描述細胞骨架力的變化。Parpura等用原子力顯微鏡(AFM)觀察神經元和神經膠質細胞在活體狀態下質膜下微絲的運動，由于圖像具有直觀、實時、動態的特點，從而提出了納米外科學的概念，即對細胞進行納米級的人工操作，以達到對病理細胞進行“手術”的目的。 應用前景原子力顯微鏡(AFM)技術在生物學領域的應用有賴于樣品制備方法和適合針尖-樣品相互作用的緩沖液的研究。原子力顯微鏡(AFM)現已成為一種獲得樣品表面結構高分辨率圖像的有力工具。而更為吸引人的是其觀察生化反應過程及生物分子構象變化的能力。因此，原子力顯微鏡(AFM)在生物學領域中的應用前景毋庸置疑。而對于原子力顯微鏡(AFM)技術本身，以下幾個方面的進展將更加有利于它在生物學中的應用。大多數生物反應過程相當快速，原子力顯微鏡(AFM)時間分辨率的提高有助于這些過程的觀察。生命科學研究有其自身特點,需設計出適合生物學研究的原子力顯微鏡(AFM)。高分辨率是原子力顯微鏡(AFM)的優勢。其分辨率在理論上能達到原子水平，但目前還沒有實現，如何作出更細的針尖將有助于其分辨率的進一步提高。而隨著樣品制備技術的完善，原子力顯微鏡(AFM)必將成為生物學領域中一種常規的研究工具。

參考文獻

1. David p Allison Peter Hinter Dorfer and Wenhai Han ,Biomolecular force measurement and the atomic force microscope, Biotechnology 2002 volume:13 issue:1 47-51
2. Thomas E Fisher Andres F Oberhanser, The study of protein mechanics with the atomic force microscope, Biochemical sciences 1999 volume:24 issue:10 379-384
3. 李鴻業夏國偉原子力顯微鏡及其在生物醫學中的應用，濱州醫學院學報。1997年第20卷第6期：615－617
4. 劉麗麗王金華劉安偉原子力顯微鏡對APA生物薄膜超微結構的研究，中國生物醫學工程學報。1999年第18卷第1期：30－34
5. 戴燕張平城等人免疫球蛋白G的原子力顯微鏡觀察，中國免疫學雜志。1995年第 11卷1期：45－47
6. 鄧國宏徐啟旺等細菌波動生長過程的原子力顯微鏡觀察，第三軍醫大學學報。2000年第22卷11期：1111－1112
7. 候淑蓮李石玉原子力顯微鏡在生命科學研究中的應用，中國醫學物理學雜志。2000年第17卷第4期：235－238
8. 王黎明李楠周春喜顯微鏡家族的新成員－原子力顯微鏡，軍醫進修學院學報。1999年第20卷第3期：237－238
9. 魯瑋瑗原子力顯微鏡對紅細胞表面形態的研究，北京生物醫學工程。1995年第14期第1卷：232－234
感謝作者：北京大學血液流變學研究中心 許曉風